DNA雙鏈斷裂損傷及同源重組修復參與人絨癌細胞化療高敏的機制研究.pdf

1、目的:
　　1.驗證甲氨蝶呤（MTX）及順鉑是否能誘導腫瘤細胞的DNA雙鏈斷裂損傷。
　　2.研究 DNA雙鏈斷裂損傷及同源重組修復通路是否參與介導人絨毛膜癌細胞的化療高敏性。
　　材料和方法:
　　1．細胞系：（1）甲氨蝶呤高敏組：人絨毛膜癌細胞株 JAR，JEG-3；（2）甲氨蝶呤敏感組：骨肉瘤細胞株 MG63；（3）甲氨蝶呤不敏感組：上皮性卵巢癌細胞株A2780以及宮頸腺癌細胞株Hela；
　　2．M

2、TT法檢測上述五株腫瘤細胞對甲氨蝶呤的敏感性，并根據(jù)半數(shù)抑制濃度（IC50）選擇合適的藥物處理濃度及濃度梯度。
　　3．中性彗星實驗檢測甲氨蝶呤是否能誘導上述五株腫瘤細胞內(nèi)的DNA雙鏈斷裂損傷；
　　4．Western Blot檢測甲氨蝶呤敏感細胞株中藥物處理后DNA雙鏈斷裂損傷標志物γH2AX蛋白的表達水平；
　　5．RT-PCR檢測濃度梯度藥物處理后上述五株細胞同源重組修復相關(guān)基因表達水平的差異；
　　6．W

3、estern Blot驗證同源重組修復差異蛋白的表達水平以及凋亡蛋白p53的表達變化。
　　7．將甲氨蝶呤替換為順鉑，在兩株人絨毛膜癌細胞株 JAR及 JEG-3中，重復MTT，中性彗星實驗，RT-PCR和Western Blot試驗。
　　結(jié)果:
　　1. MTT檢測不同濃度的甲氨蝶呤處理人絨毛膜癌細胞 JAR、JEG-3、骨肉瘤細胞 MG63、上皮性卵巢癌細胞 A2780及宮頸腺癌細胞 Hela的藥物敏感性。結(jié)果：

4、 JAR、JEG-3、MG63對甲氨蝶呤敏感，IC50分別是：28.39±3.02μM，23.70±2.58μM，30.92±3.51μM； A2780及Hela對甲氨蝶呤的IC50>400μM。
　　2.用五株細胞對應的甲氨蝶呤IC50分別處理細胞24h和48h以后，通過中性彗星實驗檢測到 JAR、JEG-3細胞有明顯拖尾現(xiàn)象，平均尾長分別為88.50±2.31μm、121.71±5.21μm；平均尾相分別為30.97±2.86

5、、41.85±5.59。MG63細胞只有輕微的拖尾現(xiàn)象：平均尾長為47.54±2.52μm，平均尾相為14.65±3.29；各組細胞的平均尾長和平均尾相與對照組相比，P<0.05，差異有顯著的統(tǒng)計學意義。而A2780和Hela細胞則未觀察到細胞拖尾現(xiàn)象。
　　3.Western Blot檢測甲氨蝶呤以不同濃度及不同時間處理的JAR、JEG-3、MG63細胞中γH2AX蛋白的表達。結(jié)果：隨著甲氨蝶呤作用濃度升高及作用時間的延長，絨癌

6、細胞 JAR、JEG-3中γH2AX蛋白表達水平明顯升高；在MG63細胞中γH2AX蛋白表達水平開始有略微升高，但隨著藥物作用濃度的增加和作用時間的延長，γH2AX蛋白表達水平降低或不表達。
　　4. PCR檢測甲氨蝶呤以不同濃度處理的JAR、JEG-3、MG63、A2780、Hela細胞中同源重組修復相關(guān)基因 RAD51、RAD52、BRCA1、BRCA2的表達。結(jié)果：甲氨蝶呤處理的JAR、JEG-3細胞中 RAD51的表達顯著

7、抑制，P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義；而 RAD52、BRCA1、BRCA2的表達未見顯著差異；MG63細胞中 RAD51的表達有輕微抑制，余基因未見明顯改變；A2780、Hela細胞中四種關(guān)鍵的同源重組修復基因的表達水平均無差異。
　　5.Western Blot檢測甲氨蝶呤以不同濃度及不同時間處理的JAR、JEG-3、MG63細胞中 RAD51蛋白、p53的表達。結(jié)果：JAR、JEG-3細胞中RAD51的表達被抑制，p53表達

8、升高，呈顯著的濃度和時間依賴效應，而MG63中 RAD51蛋白的表達僅有輕微降低，p53表達量短暫升高，并隨著刺激時間的推移，抑制效應解除，p53表達降低。
　　6.順鉑以不同濃度和時間處理JAR、JEG-3細胞，重復上述實驗步驟。結(jié)果：兩株絨癌細胞JAR、JEG-3對順鉑都是極其敏感的，半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為1.72±0.56μM，1.53±0.22μM。中性彗星實驗檢測順鉑以相應的IC50濃度分別處理兩株絨癌細胞24h

9、和48h后，未觀察到明顯的細胞拖尾現(xiàn)象。順鉑濃度梯度及時間梯度刺激后，細胞內(nèi)γH2AX在高濃度及長時間作用下表達升高，相應的RAD51蛋白的表達水平也同步升高，而凋亡蛋白p53及Caspase3表達水平也隨著順鉑處理濃度及時間的增加而升高。
　　結(jié)論:
　　1． MTX誘導人絨癌細胞持續(xù)性 DNA雙鏈斷裂損傷，同時其同源重組修復蛋白 RAD51的表達易被抑制，這種易損傷及低修復的特性可能介導其化療高敏性；
　　2．順鉑