脊髓鉀氯共同轉(zhuǎn)運體亞型2在腸易激綜合征內(nèi)臟高敏的機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是臨床上常見的功能性胃腸病。內(nèi)臟敏感性增高（visceral hypersensitivity）作為IBS重要的病理生理特征之一，其具體機(jī)制仍不明了。鉀氯共同轉(zhuǎn)運體亞型2(K+-Cl-cotransporter isofom2，KCC2)是維持神經(jīng)元氯離子穩(wěn)態(tài)(chloride homeostasis)的一種重要膜蛋白，可通過影響脊髓水平GABA/甘氨酸

2、能突觸抑制效率而控制內(nèi)臟痛覺信息的傳遞效能。本研究對脊髓KCC2與IBS內(nèi)臟高敏感之間的關(guān)系進(jìn)行初步的探討，以進(jìn)一步了解IBS內(nèi)臟高敏感的發(fā)生機(jī)制，為IBS等功能性胃腸病的臨床防治提供新的靶點和策略。
　　方法:(1)通過對雄性Wistar大鼠每天1小時、連續(xù)10天的避水應(yīng)激(wateravoidance stress，WAS)干預(yù)建立慢性內(nèi)臟高敏感模型。采用結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectaldistension，CRD)引起的腹部

3、收縮反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)評分及腹外斜肌肌電記錄(electromyography，EMG)來檢測大鼠內(nèi)臟敏感性;結(jié)腸病理組織學(xué)檢測腸道的炎癥反應(yīng)。(2)實時定量PCR、Western免疫印記和免疫熒光用于檢測腰骶段及胸腰段脊髓背角氯離子穩(wěn)態(tài)相關(guān)蛋白的表達(dá)及細(xì)胞定位。(3)制備成年大鼠的脊髓薄片，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)評估慢性應(yīng)激狀態(tài)下脊髓Ⅰ板層神經(jīng)元的氯離子穩(wěn)態(tài)及排氯能力的改變。(4)通過

4、鞘內(nèi)注射的方式給予KCC2抑制劑R-(+)-丁基吲哚酮(R-(+)-butylindazone，DI OA)觀察其對內(nèi)臟敏感性的影響。
　　結(jié)果:(1)連續(xù)10天的避水應(yīng)激刺激可誘導(dǎo)大鼠內(nèi)臟敏感性的增高，表現(xiàn)為大鼠對CRD的反應(yīng)閾值明顯下降(假應(yīng)激組，35.8+1.8 mmHg;避水應(yīng)激組，25.8±2.4mmHg; p＜0.01)，且AWR評分及EMG幅度顯著增加，而內(nèi)臟高敏感大鼠的結(jié)腸組織無明顯炎癥損傷。(2)與對照組相比，內(nèi)

5、臟高敏感大鼠腰骶段脊髓背角的KCC2總蛋白（約降至對照組的65％; p=0.01）、蛋白單體（約降至對照組的74％，p＜0.01）及多聚體表達(dá)（約降至對照組的57％，p＜0.01）均顯著下降，且發(fā)生這種變化的細(xì)胞部位主要集中在神經(jīng)元。而作為調(diào)控氯離子穩(wěn)態(tài)的另一種膜蛋白鈉鉀氯共同轉(zhuǎn)運體亞型1(Na+-K+-Cl-cotransporter isoform1，NKCC1)的表達(dá)沒有明顯改變(p＞0.05)。(3)避水應(yīng)激內(nèi)臟高敏感模型KCC

6、2的下降可導(dǎo)致脊髓背角氯離子穩(wěn)態(tài)被破壞，主要表現(xiàn)為Ⅰ板層神經(jīng)元的氯離子平衡電位（equilibrium potential，ECl）向去極化方向產(chǎn)生了約11 mV的偏移（假應(yīng)激組，-62.4±0.9 mV;慢性避水應(yīng)激組，-51±1.7 mV; p＜0.01），神經(jīng)元排氯能力顯著下降。(4)鞘內(nèi)給予KCC2抑制劑DIOA（30μg）可快速并可逆地增強正常大鼠的內(nèi)臟痛覺敏感性，表現(xiàn)為40和60 mm Hg擴(kuò)張壓力下的EMG幅度在給藥20分