實時三維超聲激勵瘤內(nèi)注射微泡增強VX2移植瘤化療.pdf

1、腫瘤治療方法主要包括手術(shù)切除、放療、化療、介入治療、高強度聚焦超聲治療、射頻消融、激光治療等?；煘閭鹘y(tǒng)治療的重要手段之一，具有以下獨特優(yōu)勢:①作用于分裂期細胞，包括腫瘤干細胞，治療腫瘤原發(fā)病灶及遠處轉(zhuǎn)移灶;②降低機體免疫抑制。然而，化療療效受到某些因素的限制:①抗腫瘤藥物在腫瘤組織內(nèi)難以達到有效濃度;②靜脈給藥所致的全身不良反應(yīng)限制了給藥的劑量;③抗腫瘤藥物的半衰期一般較短，腫瘤組織內(nèi)難以穩(wěn)定地維持有效藥物濃度。因此，提高腫瘤局部藥物

2、濃度是化療的關(guān)健。
　　 大量的實驗研究表明，超聲激勵微泡“空化效應(yīng)”能夠提高腫瘤細胞內(nèi)藥物濃度，抑制瘤體生長。超聲波輻照微泡，微泡發(fā)生振蕩、收縮、膨脹等一系列動力學(xué)過程，即“空化效應(yīng)”;由此產(chǎn)生的微束流或沖擊波能使微泡周圍的細胞膜形成孔隙，即“聲孔效應(yīng)”，膜外的分子進入細胞內(nèi)?！奥暱仔?yīng)”又分為“可逆聲孔效應(yīng)”和“不可逆聲孔效應(yīng)”。
　　 治療超聲激勵微泡增強腫瘤化療已有大量的文獻報道，很多學(xué)者探討了治療超聲聲強度、脈

3、沖方式、占空比、頻率、輻照時間等參數(shù)優(yōu)化問題;評估微米級微泡、液—氣相交微泡、載藥微泡以及同時具備診斷和治療功能的微泡等對療效的影響;觀察不同腫瘤細胞和移植瘤模型的療效。
　　 二維診斷超聲激勵微泡也有文獻報道，適宜的機械指數(shù)(MI)、輻照時間，二維診斷超聲激勵微泡能夠在細胞膜上形成孔隙;增強微血管的通透性，紅細胞外溢，骨髓—間充質(zhì)干細胞也可以透過微血管壁至心梗部位誘導(dǎo)微血管新生。
　　 而實時三維超聲激勵微泡的實驗研究

4、鮮有報道。
　　 離體細胞實驗，造影劑微泡直接混于腫瘤細胞懸液中，貼近細胞。在體實驗，造影劑微泡采用經(jīng)靜脈注射途徑給予，微泡在微血管內(nèi)流動，且受肺循環(huán)的影響。已有文獻證實，采用瘤內(nèi)注射途徑給予微泡聯(lián)合治療超聲輻照能夠增加腫瘤細胞內(nèi)鑭顆粒數(shù)目;但透射電鏡圖顯示細胞內(nèi)鑭顆粒只有2個。
　　 臨床診斷超聲設(shè)備，超聲場的強度用機械指數(shù)(MI)表示，機械指數(shù)取決于峰值負壓的最大值(Pr)和聲場的中心頻率(f)。MI＜0.3，認為聲

5、場強度是低的;0.3＜MI＜0.7，超聲波對新生的肺組織和腸管可能存在輕微的損傷;MI＞0.7，無論液體中是已否存在微氣泡，都有可能發(fā)生“空化效應(yīng)”，且這一可能性隨著MI值的增大而增大;臨床診斷超聲設(shè)備MI設(shè)置的上限為1.9。
　　 造影劑微泡——聲振方式制備的全氟丙烷人血白蛋白微球注射劑（“全氟顯”），人血白蛋白包裹核心氣體全氟丙烷制成平均直徑為2.5～4.0μm的微球混懸液。核心氣體全氟丙烷的血中溶解度非常低，因此氣體難于從

6、微球中擴散至血液，全氟丙烷氣體可穩(wěn)定的存在于微球中隨血流流經(jīng)全身;當(dāng)采用經(jīng)兔耳緣靜脈注射的途徑給予“全氟顯”時，微球流經(jīng)肺循環(huán)，因全氟丙烷核心氣體的氣血分配系數(shù)非常大，按照亨利定律，一部分核心氣體全氟丙烷將會迅速從肺毛細血管進入到大氣中，剩余一定比例的“全氟顯”跨肺進入左心，隨血流流經(jīng)各臟器微循環(huán)實現(xiàn)該部位的超聲顯影。
　　 “全氟顯”在微血管內(nèi)循環(huán)時，由于其粒徑多在微米級，不能透過微血管壁進入組織間隙，超聲和微泡的相互作用主要

7、發(fā)生在血管腔，以直接損傷血管內(nèi)皮為主。
　　 兔VX2腫瘤是由Shope病毒在兔皮膚上誘發(fā)產(chǎn)生的惡性乳頭狀瘤，經(jīng)72次傳代培養(yǎng)后正式建立命名為VX2，是一種可移植的廇株，無排斥反應(yīng)，可接種在兔的任何內(nèi)臟、骨骼及軟組織內(nèi)穩(wěn)定地生長。兔VX2肌肉腫瘤模型與接種于肝、腎、骨骼、肺等部位的腫瘤模型相比具有其獨特的優(yōu)勢:①腫瘤位置表淺，可通過經(jīng)皮膚表面捫及的方式早期發(fā)現(xiàn)成瘤，可用于早期腫瘤治療的研究及療效評價;而其他部位接種的腫瘤位置較深

8、，其觀察常需要借助影像學(xué)手段，也易受時間和空間的制約，致使發(fā)現(xiàn)成瘤的時間相對延后。②發(fā)生轉(zhuǎn)移的時間較晚、部位較單一，接種25天后才發(fā)現(xiàn)肺部有小的轉(zhuǎn)移灶，至自然死亡時僅發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移;其他部位接種的腫瘤均較早發(fā)生肺、肝、縱膈淋巴結(jié)和大網(wǎng)膜等部位的轉(zhuǎn)移。因此，該模型是一種較為理想的用于腫瘤局部治療療效評價及局部治療對肺轉(zhuǎn)移影響的動物模型。
　　 腫瘤體積＞2mm3或腫瘤細胞個數(shù)＞107個時，腫瘤繼續(xù)增殖所需的充足氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)就需要由生

9、成新生血管來提供。腫瘤體積增長超過1～2mm3，若無新生血管伸入，腫瘤組織將會持續(xù)休眠或者發(fā)生退化。一旦新生血管伸入腫瘤內(nèi)，供給充足的血液，腫瘤組織將快速生長并且難以制止。
　　 多柔比星(Dox)為蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，抗瘤譜廣，廣泛應(yīng)用于實體瘤和血液惡性腫瘤的治療，對乏氧細胞有效;臨床上一般使用其鹽酸鹽，為橘紅色結(jié)晶，易溶于水;Dox口服吸收不良，臨床上一般靜脈注射給藥或者動脈給藥;藥物通過主動轉(zhuǎn)運進入細胞;阻止DNA的復(fù)制，也

10、影響RNA的轉(zhuǎn)錄。研究顯示Dox在整個細胞周期均有活性作用，包括細胞間期。Dox獨具熒光特性，易于檢測其在細胞內(nèi)的藥物濃度。
　　 本項實驗研究在于觀察實時三維超聲激勵微泡能否增強移植瘤化療，造影劑微泡采用瘤內(nèi)注射途徑給予。實時三維超聲，一方面可以顯示較深部位腫瘤，另一方面可以對腫瘤進行輻照。本實驗中建立的VX2移植瘤模型，發(fā)生轉(zhuǎn)移的時間較晚、部位單一，接種25天后才發(fā)現(xiàn)肺部有較小的轉(zhuǎn)移灶，至自然死亡時僅僅發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。對肌層內(nèi)的

11、腫瘤進行實時三維超聲輻照聯(lián)合瘤內(nèi)注射微泡，以期為深部位腫瘤行實時三維超聲激勵瘤內(nèi)注射微泡增強化療的實驗研究提供基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 探討實時三維超聲輻照瘤內(nèi)注射造影劑微泡增強VX2移植瘤化療效果的可行性。
　　 材料和方法：
　　 1.主要實驗材料
　　 實驗儀器與試劑:①超聲輻照儀采用具有診斷作用的ViVi E9(GE公司制造)3V-D探頭，頻率1.5～4.0MHz。超聲診斷儀采用Phil

12、ips iU22彩色多普勒超聲儀，L9-3高頻線陣探頭，頻率4.0～9.0MHz，配有超聲造影模式。②造影劑微泡采用“全氟顯”（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院自制），其成膜材料為人血白蛋白，核心氣體為全氟丙烷。實驗時以3ml生理鹽水溶解并緩慢搖勻，制成混懸液用做瘤體顯影及瘤內(nèi)注射，所產(chǎn)生微泡粒徑范圍2.5～4.0μm，濃度0.8～2.2×109個/ml;瘤內(nèi)注射微泡體積=1/2×瘤體體積。③注射用鹽酸多柔比星（Dox，深圳萬樂藥業(yè)有限公司）10m

13、g/瓶，每瓶5ml生理鹽水稀釋，每只兔1.2ml/kg經(jīng)兔耳緣靜脈注射。
　　 其他試劑:速眠新Ⅱ注射液，阿托品，3％戊巴比妥鈉，肝素。
　　 實驗動物:29只健康新西蘭大白兔，雌雄不限，體質(zhì)量2～2.5kg。另取2只健康新西蘭大白兔，供廇株傳代用。所用實驗動物均由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。2支凍存的VX2廇株由中山大學(xué)實驗動物中心提供。
　　 2.VX2移植瘤模型
　　 2支凍存的VX2廇株常規(guī)復(fù)蘇

14、，分別制備成2.0ml組織懸液，分別取1ml接種至傳代兔右后肢外側(cè)肌層內(nèi)各1處。第14天，運用0.35ml/kg速眠新Ⅱ注射液和0.25ml/kg阿托品注射液將傳代兔進行肌肉注射麻醉，并建立耳緣靜脈通道以注射適量3％戊巴比妥鈉，側(cè)臥位固定于實驗臺上，荷瘤部位及其周圍1.5cm處脫毛，充分暴露，碘伏及酒精先后分別消毒兩次，無菌條件下取出瘤體，并迅速剔除周邊結(jié)締組織及中央壞死區(qū)，將剩余的新鮮魚肉樣組織置于無菌生理鹽水中，眼科剪將其剪成1mm

15、3的瘤粒，接種至29只健康新西蘭大白兔右后肢外側(cè)肌層內(nèi)，均1處。
　　 3.實驗方法
　　 超聲診斷儀監(jiān)測腫瘤生長情況:第11天，24只新西蘭大白兔存活，且瘤體造影劑微泡充盈，大小0.2～0.9cm3，全部用于實驗。具體步驟如下:①隨機分為4組。A組:空白對照(Control)，不給予任何治療;B組:單純靜脈注射注射多柔比星(Dox);C組:實時三維超聲輻照瘤內(nèi)注射造影劑微泡(3-D+Bubble);D組:實時三維超聲輻

16、照瘤內(nèi)注射造影劑微泡及靜脈注射多柔比星（3-D+Bubble+Dox）。②超聲診斷儀定位腫瘤。③超聲輻照儀輸出強度的機械指數(shù)(MI)1.3，頻率1.5～4.0MHz，輻照時間為20min;超聲診斷儀引導(dǎo)下瘤內(nèi)注射微泡;經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢注射多柔比星;3V-D探頭立即輻照瘤兔;第1、3、5、8天對腫瘤進行治療。④第10天取材，HE染色觀察腫瘤病理組織學(xué);每次治療前及第10天取材前測量瘤體大小:超聲診斷儀探測腫瘤最大縱切面，測量腫瘤最大上下徑

17、(a)、前后徑(b)，在與最大縱切面垂直的切面上測量瘤體最大左右徑(c)，并計算腫瘤體積、瘤體相對生長率及總體生長率;4組分別依次進行。
　　 4.腫瘤體積、瘤體相對生長率及總體生長率
　　 腫瘤體積(V)=∏/6×a×b×c(cm3)
　　 瘤體相對生長率=（Vn-V1）/（Vn'-V1'）×100％，(Vn，V1)、(Vn'，V1')分別是處理組和對照組第n天及第1天治療前的體積
　　 瘤體總體生長率

18、=（V10-V1）/（V10'-V1'）×100％
　　 5.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件包對數(shù)據(jù)進行處理，腫瘤體積用(x)±s表示。單因素方差分析比較同一時間組間瘤體相對生長率及總體生長率。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 ①HE病理組織學(xué):D組以凝固性壞死為主，C組廣泛的細胞固縮，B組壞死細胞分布于排列紊亂無極性的腫瘤細胞之中，A組浸潤性生長的腫瘤細胞中見不