VAC治療銅綠假單胞菌生物膜感染創(chuàng)面療效與機制的實驗研究.pdf

1、背景：
　　糖尿病足、壓力性潰瘍以及下肢靜脈潰瘍等慢性創(chuàng)面是臨床常見的疾病，不僅為患者帶來極大的痛苦和不便，也讓家庭及社會承受巨大的經(jīng)濟負擔。以前，人們認為慢性感染創(chuàng)面的細菌與生長在培養(yǎng)液中的浮游細菌并無差異。但近20年的研究表明慢性創(chuàng)面的細菌以一種生物膜的形態(tài)生長。生物膜感染的標志性特點是很難被機體的免疫機制清除并且對抗生素等治療不敏感，形成組織反復的感染并且延遲愈合。細菌生物膜也被認為是臨床慢性創(chuàng)面持續(xù)或反復感染、延遲愈合的主

2、要原因。
　　所以，進行針對性治療生物膜感染的研究非常需要并具有重要意義。然而，迄今為止，關(guān)于治療生物膜慢性感染的具有實用性的研究非常有限。以往的研究主要集中于各種新型敷料的研制，但臨床研究表明敷料治療生物膜感染并未取得較好效果；探尋有效的分子靶點相關(guān)研究目前基本仍為體外實驗，只有非常少的一部分研究進行了活體實驗。所以，臨床上慢性創(chuàng)面的治療仍是傳統(tǒng)的清創(chuàng)、沖洗以及抗生素治療，探尋一種有效的、并且具有實用性的生物膜慢性感染創(chuàng)面的治療

3、手段具有重要意義。
　　封閉負壓引流治療（VAC）自從1993年Fleischmann首次應(yīng)用以來，目前廣泛的應(yīng)用于臨床各種創(chuàng)面治療，而其治療慢性創(chuàng)面以及感染創(chuàng)面的療效尤其引人關(guān)注。目前VAC治療創(chuàng)面的機制主要歸納為：增加局部血流、清創(chuàng)壞死、減輕水腫、釋放生長因子（由于機械剪切力作用）以及減輕細菌負荷。雖然許多的研究證明VAC可以減輕創(chuàng)面的細菌負荷，但是從沒有研究將VAC針對性的應(yīng)用于治療生物膜感染這一慢性創(chuàng)面形成的主要原因。所以

4、，本研究通過體內(nèi)及體外實驗針對性研究 VAC治療 PA生物膜感染創(chuàng)面的效果并對其機制進行較深入的研究。實驗共分以下四個部分：
　　方法與結(jié)果：
　　1.構(gòu)建兔耳銅綠假單胞菌生物膜感染創(chuàng)面模型。首先將銅綠假單胞菌在體外培養(yǎng)形成生物膜結(jié)構(gòu)，通過掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡、細菌計數(shù)等手段于1d、3d及5d觀察是否形成生物膜結(jié)構(gòu)。將成熟的生物膜培養(yǎng)片(5d)置于兔耳缺血創(chuàng)面，通過改良革蘭氏染色、掃描電鏡、透射電鏡以及圖像分析等方法，

5、觀察創(chuàng)面表面及深部細菌形態(tài)以及創(chuàng)面愈合情況。結(jié)果：銅綠假單胞菌在體外培養(yǎng)5 d形成成熟生物膜結(jié)構(gòu)，將培養(yǎng)片置于兔耳缺血創(chuàng)面3d后形成穩(wěn)定的生物膜感染創(chuàng)面并明顯延遲創(chuàng)面愈合。
　　2.應(yīng)用封閉負壓引流治療兔耳銅綠假單胞菌生物膜感染創(chuàng)面。實驗分為生物膜對照組（CT組），清創(chuàng)對照組（DC組）以及負壓治療組（VAC組）。負壓治療組根據(jù)壓力不同分為-50mmHg組、-75mmHg組、-100mmHg組及-125mmHg組。各組分別于治療前、

6、治療后1、3、7、14及20天觀察創(chuàng)面愈合情況與細菌計數(shù)。CT組、DC組以及VAC(-75mmHg)組，于治療前、治療后3、6、9、及14天切取組織進行病理學觀察、炎癥因子檢測、透射電鏡以及掃描電鏡觀察。結(jié)果：CT組及 DC組創(chuàng)面仍存在細菌生物膜結(jié)構(gòu)，VAC組創(chuàng)面細菌生物膜結(jié)構(gòu)破壞，細菌負荷明顯降低（P<0.05），創(chuàng)面愈合加快（P<0.05）。VAC組間比較，-75mmHg組效果最好。VAC(-75mmHg)組肉芽組織增殖速度及炎癥因

7、子表達水平高于清創(chuàng)對照組（均P<0.05）。
　　3.應(yīng)用封閉負壓引流治療銅綠假單胞菌生物膜的體外研究。實驗分為 VAC(-75mmHg)組以及對照組（CT組），應(yīng)用VAC治療24h后，通過活菌計數(shù)、激光共聚焦顯微鏡及結(jié)晶紫染色法觀察創(chuàng)面活菌及生物膜數(shù)量，掃面電鏡觀察細菌形態(tài)，RT-PCR檢測exoS、exoT、pslA、pelA、rsmY、rsmZ、cbrA及crcZ基因表達變化。結(jié)果：與對照組相比，VAC治療后細菌數(shù)量無明顯差

8、異，生物膜成分明顯減少，細菌由生物膜形態(tài)向浮游形態(tài)轉(zhuǎn)化。PA急性感染狀態(tài)的標志基因exoS與exoT表達明顯增加（P<0.01），慢性感染狀態(tài)的標志基因pslA與pelA表達明顯下降。rsmY基因與rsmZ基因表達變化并無明顯差異，cbrA基因與crcZ基因表達明顯減低。
　　4. VAC通過Crc調(diào)控銅綠假單胞菌慢性感染向急性感染的轉(zhuǎn)化。對銅綠假單胞菌野生型菌株P(guān)AO1、crc突變株以及PAO12A（crc突變互補株）群集運動能

9、力、泳動能力、綠膿菌素生成及生物膜形成量進行檢測，觀察 Crc對 PA的影響。將三種菌株培養(yǎng)的生物膜應(yīng)用 VAC進行體外研究，觀察其生物膜形成量的變化以及exoS、pslA、cbrA及crcZ基因表達變化。結(jié)果：crc突變株群集運動能力、泳動能力下降，綠膿菌素及生物膜生成增加，PAO12A與PAO1菌株結(jié)果較接近。應(yīng)用VAC干預后，PAO12A與PAO1生物膜形成量下降，crc突變株無明顯變化。crc基因突變株exoS、pslA、cbr

10、A及crcZ基因在VAC作用后無明顯改變，PAO1及PAO12A菌株 exoS基因表達增強，pslA、cbrA及crcZ基因表達下降。
　　結(jié)論：
　　將體外培養(yǎng)PA生物膜置于兔耳缺血創(chuàng)面可形成可靠、可重復的PA生物膜感染創(chuàng)面模型。單一清創(chuàng)手段并不能有效的清除PA生物膜感染創(chuàng)面內(nèi)細菌，而VAC治療可以加強創(chuàng)面局部中性粒細胞對細菌的吞噬而降低細菌負荷，并加快肉芽組織增殖而促進PA生物膜感染創(chuàng)面的愈合。VAC單一的機械力作用并不