牡丹韌皮部蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理研究及關(guān)鍵基因挖掘.pdf

1、牡丹（Paeonia suffruticosa）是眾人皆知的觀賞花卉，卻不適宜盆栽種植，大大阻礙了其工廠化育苗的步伐。本研究以鳳丹（Paeonia ostii）和芍藥(Paeonia broteri)為砧木嫁接的‘洛陽紅’牡丹(Paeonia suffruticosa‘Luo Yanghong’)為試材，研究了容器栽培條件下盆栽牡丹各生長(zhǎng)發(fā)育階段的形態(tài)特征指標(biāo)、可溶性糖組分的變化、蔗糖在植株體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)路徑、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（PsSUT2

2、）的克隆及表達(dá)以及與蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)基因的挖掘等內(nèi)容，為拓寬牡丹栽培范圍、實(shí)現(xiàn)分子育種和遺傳改良提供理論和技術(shù)方面支持。主要研究結(jié)果如下:
　　1.形態(tài)特征指標(biāo)
　　年生長(zhǎng)周期中，兩種砧木嫁接的牡丹株高、冠幅變化趨勢(shì)相似，差異不顯著，而芍藥砧‘洛陽紅’新枝長(zhǎng)、成花數(shù)量、花蕾的高度和直徑等均優(yōu)于鳳丹砧牡丹，差異顯著，芍藥砧牡丹較鳳丹砧牡丹更適宜用作容器栽培。
　　2.可溶性糖組分的變化
　　年生長(zhǎng)周期中，蔗糖在鳳

3、丹砧牡丹葉片中的積累量明顯高于芍藥砧牡丹葉片（夏季休眠期除外），與鳳丹砧‘洛陽紅’成花數(shù)量少，庫強(qiáng)不足有一定關(guān)系;葉柄是蔗糖運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ?，有時(shí)也可以暫時(shí)貯存蔗糖;花后生長(zhǎng)期是鱗芽積累蔗糖及生理代謝高峰期，因此花后增施磷鉀肥有利于牡丹的花芽發(fā)育;冬季休眠期兩根砧根和老莖是貯存蔗糖的主要器官，鳳丹砧老莖表現(xiàn)出比芍藥砧老莖更強(qiáng)的貯存蔗糖能力，芍藥砧老莖中蔗糖則更多地回流到根中貯存，而整個(gè)生長(zhǎng)期芍藥砧根中蔗糖水平持續(xù)下降，為牡丹的生長(zhǎng)源源不斷

4、地提供碳源物質(zhì);而在秋后生長(zhǎng)期，當(dāng)鳳丹砧‘洛陽紅’葉、葉柄和芽代謝活動(dòng)基本停止的時(shí)候，芍藥砧‘洛陽紅’葉、葉柄和芽依然保持較高的代謝狀態(tài)，秋后生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)更有利于芍藥砧葉片利用光合作用合成蔗糖流向根中貯存。
　　3.蔗糖在植株體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑
　　CF（Carboxyfluorescein,羧基熒光素）熒光示蹤結(jié)果表明:生長(zhǎng)期和即將休眠期，葉片主脈CF熒光被限制在韌皮部細(xì)胞內(nèi)，并未向周圍薄壁細(xì)胞擴(kuò)散，說明主脈中SE/CC與PP

5、處于共質(zhì)體隔離狀態(tài);而葉柄、新莖、老莖、根中盡管CF熒光信號(hào)強(qiáng)弱不同，生長(zhǎng)期和即將休眠期均可以觀察到CF熒光向周圍薄壁細(xì)胞擴(kuò)散的情況，說明在‘洛陽紅’牡丹的運(yùn)輸韌皮部（葉柄、新莖和老莖）中及貯藏器官（根）中，共質(zhì)體是廣泛聯(lián)系的，兩根砧牡丹間熒光示蹤結(jié)果未見明顯差異。
　　超微結(jié)構(gòu)觀察進(jìn)一步顯示兩根砧牡丹的主脈、葉柄、花瓣、生長(zhǎng)期的根、即將休眠嫁接部位、即將休眠的鳳丹根砧中胞間連絲數(shù)量較少，并觀察到篩管、伴胞細(xì)胞壁的內(nèi)突生長(zhǎng)、壁旁體

6、和囊泡的出現(xiàn)，薄壁細(xì)胞胞間隙較大、內(nèi)部含有囊泡結(jié)構(gòu)等特征，意味著這些部位中同化物的轉(zhuǎn)運(yùn)可能以質(zhì)外體途徑為主，以共質(zhì)體途徑為輔，而即將休眠期芍藥砧根中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)采取共質(zhì)體途徑。
　　4.蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PsSUT2)的克隆及表達(dá)
　　以‘洛陽紅’牡丹葉片為材料，利用RT-PCR和RACE方法從葉片中克隆了蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，將此基因命名為PsSUT2，GenBank登錄號(hào)為KC542396。該基因cDNA全長(zhǎng)2347bp，編碼6

7、01個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為64.6KD，等電點(diǎn)為6.14，編碼的氨基酸序列與葡萄同源性最高，為75.27％。該蛋白有12個(gè)跨膜螺旋，屬于MFS蛋白家族。
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR法，分析了PsSUT2基因在鳳丹砧和芍藥砧‘洛陽紅’不同生育時(shí)期不同器官中的表達(dá)情況，結(jié)果表明PsSUT2在兩根砧牡丹的不同器官中表達(dá)趨勢(shì)相似，且主要在秋后生長(zhǎng)期的葉、葉柄、鱗芽、新莖、老莖、根和盛花期的花瓣中表達(dá)，為該時(shí)期蔗糖在植株體營(yíng)養(yǎng)器官和

8、生殖器官中的轉(zhuǎn)運(yùn)做出積極貢獻(xiàn)。
　　5.蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝相關(guān)基因的挖掘
　　通過新一代測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)對(duì)小風(fēng)鈴期和盛花期‘洛陽紅’花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共有59616條unigenes被組裝，有33919條unigenes得到功能注釋，篩選得到差異表達(dá)基因共有4224個(gè)，其中有1886個(gè)上調(diào)表達(dá)，2338個(gè)下調(diào)表達(dá)。通過KEGG分析，共有698條差異基因歸為118條代謝途徑，其中碳代謝、淀粉與蔗糖代謝是主要的代謝途

9、徑，該途徑中表達(dá)量明顯發(fā)生變化的基因在牡丹開花過程中發(fā)揮著重要作用。測(cè)序結(jié)果顯示牡丹蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)家族中PsSUT1基因上調(diào)表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)了與蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的另一個(gè)新家族SWEET成員，其中8個(gè)基因差異表達(dá)（3個(gè)上調(diào)表達(dá)，5個(gè)下調(diào)表達(dá)）;參與蔗糖代謝的關(guān)鍵酶基因8個(gè)差異表達(dá)，其中轉(zhuǎn)化酶基因4個(gè)（2個(gè)上調(diào)表達(dá)，2個(gè)下調(diào)表達(dá)），蔗糖合成酶基因4個(gè)均上調(diào)表達(dá)，而蔗糖磷酸合成酶基因和PsSUT2未見差異表達(dá)。這17個(gè)差異表達(dá)的基因在‘洛陽紅’牡丹開花過程