能量代謝調(diào)節(jié)對(duì)MG132和紫杉醇聯(lián)合用藥的影響.pdf

1、背景與目的：化學(xué)治療是治療腫瘤的經(jīng)典方法之一，但是隨著治療的進(jìn)行或者腫瘤本身對(duì)化療藥物反應(yīng)性的不同，許多腫瘤對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，敏感性降低，加之化療引起骨髓抑制、神經(jīng)毒性、心血管毒性等毒副作用，不僅嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，也限制了化療藥物的應(yīng)用，增加了臨床腫瘤治療的難度。因此如何克服化療耐藥性、增加化療敏感性及降低藥物毒副作用，提高化療效果，是腫瘤治療領(lǐng)域亟待突破的問(wèn)題之一。
　　 近年來(lái)關(guān)于增加化療的敏感性和克服化療耐藥性的研究

2、表明，蛋白酶體抑制劑與化療藥物聯(lián)合使用，可有效地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)化療敏感性，克服化療耐藥性。蛋白酶體抑制劑MG132單獨(dú)或與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用均能有效的抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
　　 腫瘤的多藥耐藥性與腫瘤細(xì)胞的能量代謝水平有關(guān)，因?yàn)槎嗨幠退幍鞍讓?duì)化療藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)需要ATP的供能，有研究表明，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)療法可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。但是改變細(xì)胞的供能，尤其是減少細(xì)胞的供能，是否提高蛋白酶體與化療藥物聯(lián)合使用的療效，

3、目前的報(bào)道不多。
　　 本研究在無(wú)糖培養(yǎng)基中分別添加右旋葡萄糖（D-glucose，D-G）或左旋葡萄糖（L-glucose，L-G），改變培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的供能條件，并觀察在不同供能條件下，蛋白酶體抑制劑MG132與廣譜抗癌藥物紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MCF-7和K562細(xì)胞的抑制作用，并初步探討其作用機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 1、材料
　　 1.1細(xì)胞株：K562細(xì)胞株：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院血液學(xué)研究所；人乳腺

4、癌MCF-7細(xì)胞株，購(gòu)自廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心。
　　 1.2 試劑：紫杉醇（Paclitaxel，海南中化聯(lián)合制藥工業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20057065）;D-G （汕頭市光華化學(xué)廠）；L-G（上海西域機(jī)電有限公司）；MG132（Alexis）；紫杉醇溶于NS-20℃保存，MG132溶于DMSO-20℃保存。
　　 2、方法
　　 2.1細(xì)胞培養(yǎng)：K562細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640完全培養(yǎng)基中，隔天傳代一次；

5、MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，每?jī)商煊?.25％胰蛋白酶（含EDTA）消化傳代一次；置于37℃ 5％ CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。D-G及L-G完全培養(yǎng)基為含10％ 胎牛血清的無(wú)糖RPMI1640中分別添加D-G或L-G，并使其終濃度分別為2g/l。實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞傳代離心，調(diào)整細(xì)胞濃度，用以上配好的D-G或L-G完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并按以下實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 2.2 實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、紫杉醇組、

6、MG132 組以及紫杉醇聯(lián)合MG132組。MG132和紫杉醇的濃度根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)有所不同，紫杉醇的濃度范圍是20nM/L～10μM/L，MG132的濃度范圍是0.625μM/L～10μM/L。
　　 2.3細(xì)胞活力測(cè)定：MTS法檢測(cè)MG132與紫杉醇對(duì)K562細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞活力的影響，以及確定適當(dāng)?shù)臐舛确秶?br>　　 2.4 MG132與紫杉醇對(duì)K562細(xì)胞死亡情況的影響：采用流式細(xì)胞術(shù)以及熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞在兩

7、種供能條件下各組細(xì)胞的存活情況。
　　 2.5MG132與紫杉醇對(duì)K562細(xì)胞凋亡蛋白Bax 及PARP的影響：用Western blotting 方法檢測(cè)各組細(xì)胞Bax及PARP的表達(dá)水平。
　　 2.6 MG132與紫杉醇對(duì)K562細(xì)胞周期的影響：用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)各組用藥對(duì)K562細(xì)胞周期的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、MG132和紫杉醇對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響：
　　 1.1 MG1

8、32 2.5μM～10μM作用MCF-7細(xì)胞24h，細(xì)胞相對(duì)活力值為67.96％～52.24％，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）；MG132 1.25μM以下濃度對(duì)MCF-7細(xì)胞沒(méi)有明顯抑制效應(yīng)。
　　 1.2 D-G及L-G培養(yǎng)條件下，紫杉醇對(duì)MCF-7及K562細(xì)胞抑制作用隨劑量的增加而增強(qiáng)。紫杉醇5μM、10μM作用MCF-7細(xì)胞36h，在D-G培養(yǎng)條件下，對(duì)應(yīng)細(xì)胞活力分別為49.05％、49.09％，L-G條件

9、5μM、10μM對(duì)應(yīng)細(xì)胞活力分別為47.57％、35.09％，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；D-G條件下1μM、5μM、10μM的紫杉醇作用K562細(xì)胞24h對(duì)應(yīng)的細(xì)胞相對(duì)活力分別為77.10％、63.35％、54.61％，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；L-G 條件下5μM、10μM 紫杉醇對(duì)應(yīng)細(xì)胞相對(duì)活力分別為59.06％、50％，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　 1.3 在MCF

10、-7細(xì)胞中D-G及L-G條件下聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組相比均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在K562細(xì)胞中D-G條件下MG132 1μM與1μM、5μM、10μM 紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用的細(xì)胞活力值分別為50.97％、29.63％、15.41％，與單獨(dú)用藥組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（p<0.05）。
　　 2、MG132和紫杉醇對(duì)K562細(xì)胞死亡的影響：
　　 2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：
　　 2.1.1 L-G條件下MG132 1

11、μM與紫杉醇5μM聯(lián)合細(xì)胞凋亡顯著增加，與單用藥組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），其凋亡率顯著高于D-G條件下的凋亡率（p<0.05），在L-G下紫杉醇5μM單藥作用凋亡明顯，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。D-G條件下MG132 1μM與紫杉醇5μM聯(lián)合細(xì)胞凋亡也有增加，與單用藥組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　 2.1.2 L-G 條件下MG132 1μM與不同濃度紫杉醇20nM、1μM聯(lián)合均顯示出

12、明顯增加凋亡誘導(dǎo)的效應(yīng)，并有時(shí)間依賴性。且L-G條件下MG132 1μM與紫杉醇1μM聯(lián)合應(yīng)用24h時(shí)，K562細(xì)胞的凋亡增加顯著。
　　 2.2 PI染色細(xì)胞存活情況觀察：結(jié)果顯示，L-G條件下MG132 0.5μM 與紫杉醇20nM聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥細(xì)胞死亡增加顯著，細(xì)胞壞死增多；MG132 1μM與紫杉醇200nM聯(lián)合L-G條件下聯(lián)合用藥細(xì)胞死亡顯著增加。D-G條件下，MG132處理組和聯(lián)合用藥組，細(xì)胞死亡顯著。
　

13、　 3、MG132和紫杉醇對(duì)K562細(xì)胞Bax和PARP的影響：D-G條件下MG132處理組細(xì)胞的Bax聚集明顯，L-G條件下Bax也有聚集；D-G條件下聯(lián)合用藥組細(xì)胞的PARP切割片段顯著增加，L-G條件下沒(méi)有增加。
　　 4、MG132與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對(duì)K562細(xì)胞周期的影響：L-G條件下，紫杉醇20nM分別與MG132 0.5μM或者M(jìn)G132 1μM聯(lián)合處理K562細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞周期主要阻滯于G2-M期；隨著藥物處理細(xì)胞

14、的時(shí)間從24h延長(zhǎng)至48h時(shí)，聯(lián)合處理組的細(xì)胞阻滯于G2-M期的百分比增多。紫杉醇20nM與MG132 1μM聯(lián)合組的凋亡峰百分比亦增加。
　　 結(jié)論：
　　 1.降低細(xì)胞的能量供應(yīng)時(shí)，與單獨(dú)用藥組比較，低濃度的紫杉醇（20nM）與低濃度的MG132（0.5μM或1μM）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，阻滯細(xì)胞的周期于G2/M期，并明顯增加K562細(xì)胞的凋亡和死亡。
　　 2.降低細(xì)胞的能量供應(yīng)，能夠增強(qiáng)K562細(xì)胞對(duì)紫杉醇和MG1