紫杉醇聯(lián)合miR-200a對(duì)胃腺增殖侵襲能力影響的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的:
　　 體內(nèi)外觀察紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用miR-200a對(duì)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞增殖侵襲能力的影響，并探討可能的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1體外實(shí)驗(yàn)部分:
　　 細(xì)胞分為五組:miR-200a組，聯(lián)合組，紫杉醇組，無(wú)義序列組，對(duì)照組。紫杉醇組應(yīng)用50nmol/L紫杉醇單獨(dú)處理胃癌SGC-7901細(xì)胞48h，miR-200a組應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物(miR-200a mimics)48

2、h，聯(lián)合組為二者聯(lián)合應(yīng)用，無(wú)義序列組轉(zhuǎn)染無(wú)義序列RNA，對(duì)照組無(wú)任何處理。提取各組細(xì)胞總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(RT-PCR)檢測(cè)miR-200a轉(zhuǎn)染效果。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平和周期分布，克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的增殖能力，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的侵襲遷移能力。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)比較單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇與聯(lián)合應(yīng)用miR-200a對(duì)胃癌細(xì)胞增值侵襲能力影響的差異。提取各組細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用免疫印跡技術(shù)（Weste

3、rn-blot）檢測(cè)細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白(β-catenin)水平的變化。
　　 2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，胰酶消化后應(yīng)用PBS洗滌兩次，鏡下計(jì)數(shù)，于原代裸鼠兩側(cè)腹股溝皮下注射0.1ml細(xì)胞懸液，每側(cè)1×107個(gè)細(xì)胞。待原代裸鼠成瘤后取出瘤體并移植到子代裸鼠腹股溝皮下。當(dāng)子代裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)到大小約130mm3時(shí)，隨機(jī)分為5組，每組6只，并開始進(jìn)行治療。子代裸鼠200a組進(jìn)行瘤體原位多點(diǎn)注

4、射miR-200a與轉(zhuǎn)染試劑混合物20μL，隔天一次。紫杉醇組按裸鼠體重給予紫杉醇(20mg/kg)，腹腔注射以生理鹽水稀釋后的紫杉醇注射液，每7天給藥一次。聯(lián)合組為二者聯(lián)合應(yīng)用，無(wú)義序列組原位注射無(wú)義序列RNA，對(duì)照組不作處理。定期測(cè)量瘤體長(zhǎng)短徑，計(jì)算腫瘤體積（腫瘤體積=1/2長(zhǎng)徑×短徑2）。開始治療三周后處死裸鼠，取出瘤體石蠟包埋切片，對(duì)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色及TUNEL原位凋亡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞在體內(nèi)的增殖及凋亡情況。
　　

5、 結(jié)果:
　　 1.RT-PCR技術(shù)檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)染miR-200a mimics后，200a組及聯(lián)合組中miR-200a水平較其他三組顯著升高(P＜0.01)，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要;2.流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)表明50nmol/L紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用miR-200a細(xì)胞早期凋亡率(22.82±1.43)％高于紫杉醇組的（18.74±1.27）％（P＜0.05）;3.流式細(xì)胞儀測(cè)定顯示聯(lián)合組阻滯于G2/M期細(xì)胞比例（63.74±1.76）％高于單獨(dú)

6、應(yīng)用紫杉醇組的（51.75±2.01）％，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);4.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示聯(lián)合用藥組克隆形成率（4.03±0.25）％與紫杉醇組的（7.80±0.30）％相比顯著降低（P＜0.01）;5.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明聯(lián)合用藥組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目為22.00±2.00，少于紫杉醇組的56.33±5.13(P＜0.01);6.細(xì)胞劃痕試驗(yàn)表明在劃痕后48小時(shí)，聯(lián)合組細(xì)胞遷移率為(21.43±2.34)％，與紫杉

7、醇組遷移率(54.26±2.49)％相比已顯著降低(P＜0.01);7.β-catenin蛋白水平在聯(lián)合組及200a組中較其他各組均降低(P＜0.01)。
　　 1.裸鼠皮下腫瘤在第八次治療后，聯(lián)合組與其他各組相比，腫瘤體積已經(jīng)顯著減小(P＜0.05)直到治療結(jié)束;2.處死裸鼠取出瘤體，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色顯示，與凋亡相關(guān)的指標(biāo)Caspase-3蛋白在聯(lián)合組瘤體中表達(dá)升高，與細(xì)胞增殖相關(guān)的PCNA蛋白在聯(lián)合組中較紫杉醇組瘤體表達(dá)降