雌激素調(diào)控人類WNK4基因表達的機制研究.pdf

1、前言:WNK[With-no-lysine(K)kinase]是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,包括WNK1-4。該激酶家族成員的特點是其催化結(jié)構(gòu)域第二亞區(qū)中保守的具有錨定ATPα和β磷酸基團作用的賴氨酸位點被半胱氨酸替代,賴氨酸則位于第一亞區(qū),但是激酶的生物活性并沒有發(fā)生改變。目前,對WNK4激酶的功能研究表明WNK4在電解質(zhì)平衡和血壓調(diào)節(jié)方面扮演著重要角色?？梢?研究WNK4基因表達調(diào)控機制,不僅能闡明高血壓發(fā)生的某種機理,也為開發(fā)治療

2、高血壓新藥提供線索和目標。我們研究組成員前期通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)包括雌激素、糖皮質(zhì)激素在內(nèi)的幾種激素可以下調(diào)人類WNK4(hWNK4)基因的表達;并且通過一系列實驗驗證了糖皮質(zhì)激素通過位于hWNK4啟動子區(qū)域的糖皮質(zhì)激素反應元件負性調(diào)節(jié)該基因的表達,為闡明糖皮質(zhì)激素作為藥物應用產(chǎn)生的副作用(如鈉水儲留、堿中毒和高血壓等)提供依據(jù)。由于雌激素是生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和腦、骨骼等器官生長、發(fā)育和功能維持的重要調(diào)節(jié)子,因此有必要進一步探索雌

3、激素下調(diào)WNK4基因表達的具體機制。本研究以17β-雌二醇(E2)為刺激因素,探討雌激素對hWNK4基因表達的影響及其作用機制。
　　 材料與方法:
　　 一、實驗材料
　　 1、人胚腎HEK293細胞系;
　　 2、刺激藥物:E2、ICI182,780、放線菌素D(actinomycin-D)和放線菌酮(cycloheximide);
　　 3、RNA提取相關(guān)試劑、RT試劑盒及Real-time

4、 PCR相關(guān)試劑;
　　 4、人類c-Jun、c-Fos表達載體和人類雌激素受體alpha(Erα)表達載體;
　　 5、基因重組及螢光素酶報告基因檢測相關(guān)試劑及試劑盒;
　　 6、DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合實驗、免疫共沉淀(co-IP)、電泳泳動遷移實驗(EMSA)及染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)相關(guān)試劑;
　　 7、Western blot相關(guān)試劑。
　　 二、實驗方法
　　 1、Real-tim

5、e PCR檢測E2等藥物刺激前后hWNK4 mRNA表達水平的變化;
　　 2、利用生物信息學軟件分析hWNK4基因啟動子結(jié)構(gòu),構(gòu)建hWNK4啟動子序列系列截短的螢光素酶報告基因重組體,應用雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)檢測啟動子的活性以及E2對hWNK4啟動子活性的影響,鑒定hWNK4啟動子關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和雌激素反應區(qū);
　　 3、EMSA和ChIP實驗鑒定hWNK4啟動子內(nèi)activator protein-1(AP-1)

6、反應元件;
　　 4、應用雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)錄因子AP-1過表達對hWNK4啟動子活性的影響;
　　 5、應用DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合實驗和ChIP實驗鑒定AP-1反應元件的DNA-蛋白質(zhì)復合物組成以及檢測E2對c-Jun、c-Fos和Era蛋白與AP-1元件結(jié)合力的影響;
　　 6、通過免疫共沉淀和re-ChIP方法鑒定結(jié)合于AP-1反應元件的各轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用;
　　 7、應用雙熒光素酶活性

7、檢測系統(tǒng)和Real-time PCR方法檢測AP-1和Erα共同作用對hWNK4轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié);
　　 8、Western blot檢測E2對轉(zhuǎn)錄因子AP-1蛋白表達水平的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、Real-time PCR結(jié)果表明E2/Erα以濃度依賴的方式下調(diào)hWNK4 mRNA的表達水平;并且雌激素受體抑制劑ICI182,780和轉(zhuǎn)錄抑制劑actinomycin-D可分別抑制這種下調(diào),而蛋白合成抑制劑cy

8、cloheximide則否;
　　 2、ALiBaba2.1和TRANSFAC TESS軟件預測分析結(jié)果顯示hWNK4啟動子區(qū)域有多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件,包括GR、GATA-1、AP-1、SP-1等,但是沒有ERE;
　　 3、hWNK4基因啟動子的-216～-202區(qū)域是該基因關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和雌激素反應區(qū);
　　 4、EMSA和ChIP實驗分別在體外和體內(nèi)條件下證明了hWNK4啟動子-216～-202區(qū)存在AP

9、-1反應元件;
　　 5、通過共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄因子AP-1和hWNK4啟動子-luc載體,螢光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)AP-1可以上調(diào)hWNK4啟動子的轉(zhuǎn)錄活性;
　　 6、DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合實驗和ChIP實驗結(jié)果顯示E2/Erα可使c-Fos、c-Jun和Erα與hWNK4啟動子AP-1反應元件的結(jié)合增強;
　　 7、免疫共沉淀結(jié)合Western blot實驗和re-ChIP實驗共同驗證了c-Jun和Erα之間存在直接的相互

10、作用;
　　 8、螢光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)c-Fos/c-Jun過表達顯著增加p216-luc的活性,而E2/ERα則抑制這種活性的增加;同樣,Real-time PCR的結(jié)果也顯示E2/Erα能下調(diào)c-Fos/c-Jun誘導的hWNK4基因轉(zhuǎn)錄;
　　 9、Western blot實驗結(jié)果提示E2刺激可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子AP-1蛋白表達,并且ERα過表達會增強這種上調(diào)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、E2刺激可以下

11、調(diào)hWNK4基因mRNA表達水平;
　　 2、hWNK4基因啟動子-216～-202區(qū)域存在AP-1反應元件;
　　 3、AP-1反應元件對hWNK4啟動子的基礎轉(zhuǎn)錄活性起關(guān)鍵作用并介導E2對hWNK4基因轉(zhuǎn)錄的抑制;
　　 4、結(jié)合于hWNK4啟動子AP-1反應元件的DNA-蛋白質(zhì)復合物包括c-Jun、c-Fos和ERα,其中c-Jun和c-Fos直接結(jié)合DNA,ERα通過與c-Jun相互作用的方式間接結(jié)合DN