酵母構象型隨機肽庫的構建及BAFF-R-TRAF3復合物解離肽的篩選.pdf

1、BAFF，又稱BLyS，TALL-1，THANK，zTNF4或TNFSF-13B，是1999年發(fā)現(xiàn)的TNF家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，BAFF能促進B細胞的存活和成熟，在體液免疫中發(fā)揮重要作用，BAFF過表達會導致自身免疫性疾病。BAFF有三個受體，分別為BCMA、TACI、BAFF-R／BR3。其中BAFF-R被認為是最主要的受體。BAFF-R介導細胞內(nèi)的替代NF-~B途徑，BAFF三聚體誘導BAFF-R在膜上聚集，通過募集TRAF3接頭分子

2、，激活NF．KB。以BAFF-R／TRAF3復合物為研究對象，篩選促BAFF-R／TRAF3解離的小肽，阻斷BAFF-R介導的信號通路，可以為自身免疫性疾病的治療提供新的靶點。研究工作的結果可概括為以下幾個方面： (1)通過RT-PCR方法釣取BAFF-R胞內(nèi)區(qū)和TRAF3C端258-568aa的cDNA片段，構建重組質(zhì)粒pBD-BAFF-R和pAD-TRAF3-C，利用酵母雙雜交驗證了兩者的相互作用。構建pM-BAFF-R和p

3、VPl6-TRAF-C表達載體，共轉染COS-7細胞，利用哺乳動物雙雜交進一步驗證了兩者的相互作用。構建了一系列的TRAF3缺失突變體，利用酵母雙雜交確定TRAF3的328~400aa，428~463aa．543-560aa參與了與BAFF-R的結合。 (2)以硫氧還蛋白(Trx)為骨架，在橋質(zhì)粒pBD-BAFF-R條件型啟動子PMET25的下游構建可誘導表達的酵母構象型隨機lO肽庫。利用PCR擴增出trx基因，通過重疊延伸PC

4、R向trx的突環(huán)區(qū)引入AscI酶切位點，構建pBD-BAFF-R-mTrx重組載體。采用(NNK)10的編碼方式設計并合成兩條寡核苷酸鏈，經(jīng)退火、延伸，AscI／RsrⅡ雙酶切，克隆至pBD-BAFF-R-mTrx載體，電轉化E．coliDHlOB感受態(tài)細胞。最終獲得庫容量為8.7×1O8的酵母構象型隨機肽庫；隨機挑選20個克隆進行測序，4個核苷酸的出現(xiàn)頻率與理論值接近；免疫印跡結果表明，在Met缺陷培養(yǎng)基中，隨機肽庫可被誘導表達，表明

5、構建的肽庫是成功的。 (3)解離肽的篩選及初步的功能研究，將構建好的pBD-BAFF-R文庫質(zhì)粒轉化酵母細胞Y190(pAD．TRAF3-C)，挑選在三缺SD／-Trp／-Leu／-His培養(yǎng)基上生長良好，變藍的菌落，接種在四缺SD／-Met／-Trp／-Leu／-His培養(yǎng)基上，選擇不生長、不變藍的菌落即為預期的陽性克隆。最終得到6個候選解離肽的陽性克隆。選取2條小肽(P1、P2)進行人工合成。初步的細胞學實驗表明，Pl能特異

6、性地抑制BAFF刺激外周血B淋巴細胞增生的活性。 (4)利用酵母三雜交系統(tǒng)，以BAFF-R胞內(nèi)區(qū)／TRAF3復合物為誘餌，篩選人脾cDNA文庫，獲得新的TRAF3相互作用蛋白RIPK2，并利用哺乳動物雙雜交進一步驗證了兩者的相互作用。 本研究以BAFF-R／TRAF3復合物為例，探討了利用構建的酵母構象型隨機肽庫篩選促蛋白復合物解離的方法，獲得的解離肽可阻斷蛋白組份所介導的信號通路，對于治療由于信號通路異常激活而導致的疾