固本化痰通脈方含藥血清對大鼠VSMC的增殖及粘附分子表達的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)、冠心病是心血管系統(tǒng)中最常見的疾病之一，對其發(fā)病機制目前尚未完全闡明。動物實驗證實，血管平滑肌細胞(VascularSmoothMuscleCell,VSMC)的異常增殖是AS形成的關(guān)鍵。AS斑塊形成涉及脂類代謝障礙、血管內(nèi)皮細胞損傷、巨噬細胞浸潤、VSMC增殖和血小板聚集等多種因素。其中VSMC異常增殖在AS斑塊形成中發(fā)揮重要作用。近年來，人們在研究VSMC異常增殖與AS發(fā)生的關(guān)系時

2、，發(fā)現(xiàn)細胞死亡存在于AS發(fā)生發(fā)展的各個階段，因而推論VSMC異常增殖是由于細胞死亡和增殖平衡失調(diào)的結(jié)果。 體內(nèi)的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)是主要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其中血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)與VSMC增殖的關(guān)系一直備受關(guān)注。上述因子可最終導(dǎo)致血管內(nèi)膜異常增生和管腔狹窄。研究表明，AngⅡ具有促生長激素樣作用，可刺激心肌細胞、成纖維細胞、VSMC的DNA和蛋白質(zhì)合成增加。離體發(fā)現(xiàn)，AngⅡ作用早期促細胞分

3、裂效應(yīng)較弱，但后期DNA合成明顯增加，細胞數(shù)增多，而且對正常結(jié)構(gòu)血管的VSMC亦有促有絲分裂作用。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)大鼠頸動脈內(nèi)皮損傷后輸注AngⅡ可使新生內(nèi)膜增生加重。AngⅡ的異常分泌與VSMC增生、增殖相關(guān)，如何拮抗這一作用，抑制VSMC的異常增殖，具有重要治療價值。 近10余年來，隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)等相關(guān)基礎(chǔ)學(xué)科的迅速發(fā)展，炎癥在冠心病發(fā)病機制中的作用日益受到重視。在炎癥過程中，白細胞與血管內(nèi)皮之間的粘附是炎癥的起始步驟，

4、這一過程由炎癥細胞和血管內(nèi)皮細胞表面的細胞粘附分子所介導(dǎo)；另外，在細胞粘附分子的介導(dǎo)下，炎癥細胞沿血管內(nèi)皮細胞滾動粘附，滲透到內(nèi)皮細胞下，并分泌釋放各種細胞活性物質(zhì)，引起血管平滑肌細胞增生、泡沫細胞形成，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊的形成。細胞粘附分子在上述炎癥反應(yīng)各階段均起重要作用。因此，對細胞粘附分子的研究必將為冠心病的診斷、治療和預(yù)防開辟新的前景。 現(xiàn)有的研究成果證實，中醫(yī)藥在治療高脂血癥和AS方面有肯定的療效。中醫(yī)學(xué)以整體觀

5、念和辨證論治為特點，以療效確切、毒副作用小的優(yōu)勢，為廣大醫(yī)家所認可，也積累了豐富的經(jīng)驗。從AS虛實夾雜的病機特點出發(fā)，結(jié)合臨床實踐和實驗研究，我們認為脾腎二臟虧虛是AS發(fā)生的病理基礎(chǔ)，痰濁內(nèi)停是AS發(fā)生的病理關(guān)鍵。在發(fā)病過程中，脾腎虧虛與痰濁兩者又互相影響，互為因果。所以，本病的治療宜補腎健脾以治本，化痰降濁以治標。 本實驗我們采用了體外培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC的方法，研究了在AngⅡ刺激下VSMC的增生、增殖規(guī)律和對VSMC粘附

6、分子的表達，并探討了固本化痰通脈方含藥血清(GBHTTMP)對VSMC的增殖及粘附分子表達的影響。從而從細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)水平探討GBHTTMP抗AS的理論依據(jù)及作用機制。 目的研究在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激下VSMC的增殖規(guī)律和粘附分子的表達，并觀察GBHTTMP對大鼠VSMC增殖以及粘附分子表達的影響，揭示該方抗AS的作用機理。 方法選用健康雄性Wistar大鼠，取其胸主動脈，分離外膜和內(nèi)膜后，取其中膜進行原

7、代培養(yǎng)，VSMC的培養(yǎng)采用常規(guī)貼塊細胞培養(yǎng)方法進行。傳至四代后，用抗a-actin的免疫組織化學(xué)染色鑒定細胞。并用AngⅡ刺激細胞24h后進行分組.實驗分為4組：正常組、AngⅡ刺激組、固本化痰通脈方含藥血清高劑量組(簡稱固高組)、低劑量組(簡稱固低組)。鏡下觀察細胞生長狀況，應(yīng)用四甲基偶氮唑藍還原反應(yīng)(MTT法)、細胞計數(shù)、流式細胞技術(shù)和免疫組化檢測VSMC增殖及VCAM-1的表面表達及蛋白的表達。 結(jié)果1.AngⅡ可明顯刺激

8、VSMC增殖。在一定濃度范圍內(nèi)，呈劑量依賴性。其中以AngⅡ為10-6mol/L時最顯著。2.加入GBHTTMP含藥血清干預(yù)因素后，均抑制AngⅡ在各個作用時間的促VSMC增殖作用。與AngⅡ組比較，GBHTTMP大劑量和小劑量含藥血清可使MTTOD吸光度值下降，有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異；并能顯著抑制VSMC由靜止期向合成期轉(zhuǎn)變，使VSMC停滯在G0/G1期。AngⅡ促使細胞周期由G0/G1期向S/G2-M期轉(zhuǎn)變。10-6mol/LAngⅡ刺

9、激后，細胞逐漸進入分裂期，而加入小劑量的GBHTTMP含藥血清后，VSMC細胞周期分布發(fā)生變化，G0/G1期細胞比例增加，而合成增殖的S期細胞比例減少，出現(xiàn)G0/G1期細胞周期阻滯作用。3.流式細胞術(shù)和免疫組化結(jié)果所示，AngⅡ可使VSMC表面VCAM-1表達明顯增加，與正常組比較有顯著性差異。GBHTTMP可明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC表達VCAM-1，與模型組有顯著性差異。 結(jié)論1.AngⅡ能促進VSMC的增殖，GBHTT