虛擬氨基酸突變法分析和預測抗原抗體相互作用的關鍵位點.pdf

1、蛋白質在生物體內扮演了不可或缺的重要角色，不僅是細胞和組織的物質基礎，更參與各種機能反應的成分組成。蛋白質與配體分子的識別過程，包括抗原與抗體、酶與底物、激素與受體的識別等，參與了機體內的免疫反應、生化反應、信號轉導等幾乎所有重要的生命活動。蛋白與配體相互作用分析，是理解生命活動中的各種生物功能的分子機制和調控過程的基礎。其中，對于抗原抗體識別機制的研究，有助于疫苗的分子設計和機理解釋，有助于指導親和力成熟的治療性抗體的研究，在疾病預防

2、和臨床治療診斷應用方面，具有十分重要的意義。
　　獲得蛋白質的三維結構是分析抗原抗體的復合物體系相互作用的基礎，結構解析的實驗方法包括X射線晶體衍射、核磁共振波譜和電鏡重構等，但是由于蛋白樣品制備或實驗技技術本身的限制，許多復合物的三維結構未能獲得解析。而基于同源模型建立的分子模擬是目前準確度最高的三維結構預測方法，可根據(jù)已知氨基酸的序列比進行未知蛋白的結構預測。如果已知復合物的單體結構，分子對接的方法可以預測兩者間的結合模式和親

3、和力，尋找分子間相互識別的合理構象，能量最小化和分子動力學模擬可進一步優(yōu)化預測的空間結構，用于準確解釋蛋白結構與功能的關系。相互作用關鍵位點和相互作用機制可通過突變分析實驗來驗證，包括丙氨酸掃描和飽和突變等，突變前后親和力變化的檢測方法有生物物理手段（AUC等）、生物化學手段(SDS-PAGE等)、免疫化學手段(ELISA、WB等)，利用細胞結合/中和實驗可對突變前后的復合物進行功能性驗證。分子模擬中基于結合自由能算法而發(fā)展的虛擬氨基酸

4、突變，可以用來快速地在實驗前虛擬測試大量突變位點，根據(jù)結構變化計算突變前后的能量變化，從而得出突變位點使得復合物親和力下降或提高的結論，根據(jù)實驗目的篩選預測結果，可以指導實驗人員理性設計突變蛋白，大大減少工作量和實驗成本。如果虛擬突變預測方法能夠具有一定的準確度，甚至能夠在一定程度上替代突變實驗進行相互作用特異性分析。本論文擬通過對已知結構的復合物進行虛擬氨基酸突變研究該方法的關鍵參數(shù)和合理閾值，為虛擬氨基酸突變提供實例分析和實驗驗證。

5、
　　論文的第一部分主要針對抗原抗體復合物體系進行了相互作用界面的抗原關鍵表位的預測分析。結構模型的精細程度是預測結果準確性的首要影響因素，因此本文首選了三個抗原抗體復合物晶體結構，通過分析定義交界面的相互作用氨基酸、虛擬突變分析能量柱狀圖來預測對抗原抗體結合起關鍵作用的表位位點，提出了關鍵位點定義的結合能量變化臨界值1 kcal/mol，預測結果與突變實驗驗證結果較為吻合，且預測沒有出現(xiàn)假陽性，體現(xiàn)了一定的準確度，和較高的特異度

6、;之后，本文進行了一例廣譜中和單抗13A10與四型HPV(16/31/33/58)結合模式的預測分析，并對此分子模擬預測的抗原抗體復合物體系基于臨界值定義了關鍵表位，通過突變實驗驗證，預測結果亦體現(xiàn)了較高的準確度和特異度;第三，本文擴展引用了一例小分子體系，通過分析并與實驗結果對比，同樣得出了預測準確的結論。本部分的研究內容體現(xiàn)了該方法在預測關鍵表位方面的應用具有一定的廣泛性，準確性和特異性。
　　論文的第二部分探索了虛擬氨基酸突

7、變在抗體親和力成熟方面的應用。以抗體親和力成熟前后的兩株抗原抗體復合物為研究對象，對通過親和力提高和位點突變頻率分析得到的兩個重要位點，通過虛擬突變，將其分別由初始氨基酸突變?yōu)橛H和力成熟的氨基酸，根據(jù)能量計算分析親和力變化。雖然預測結果存在與實驗結果沒有完全吻合的現(xiàn)象，但具有一定的準確率，且已通過分子動力學模擬從結構上解釋了預測不全面的原因。
　　綜上所述，本文以四例抗原抗體復合物和一例小分子體系為例對氨基酸虛擬突變用于指導實驗的