老化免疫研究——小鼠胸腺增齡相關新基因IH-1的功能研究和抗氧化植物的篩選.pdf

1、胸腺增齡性退化與萎縮是機體老化過程中最重要的免疫系統(tǒng)表現(xiàn)，可能是決定和制約免疫系統(tǒng)老化的關鍵環(huán)節(jié)。然而胸腺萎縮的調控機制至今尚不清楚。晚近的研究表明，胸腺萎縮過程伴隨著基因表達的改變，基因表型不同的個體其胸腺萎縮的速度和程度存在明顯的差異。因此，我們推測，胸腺萎縮是一個受遺傳基因調控的過程，其中基因的變化或基因間相互作用可能共同導致胸腺萎縮。此外，本課題組以往的研究資料表明，氧化應激狀態(tài)下小鼠胸腺的結構和功能受到明顯損害，并出現(xiàn)衰老的跡

2、象，這提示氧化損傷可能參與了胸腺萎縮的過程。 本研究旨在進一步闡明胸腺萎縮的基因調控機制以及尋找延緩胸腺萎縮和改善免疫功能的有效方法。首先，我們利用生物信息學、酵母雙雜交和蛋白質相互作用驗證等技術，對已獲得的胸腺增齡相關新基因IH-1的功能進行了研究，初步明確了IH-1基因所具有的生物學功能，并探討了其與胸腺內T淋巴細胞分化發(fā)育的關系；其次，利用體外抗氧化檢測技術和氧化應激模型小鼠，對41種天然植物的抗氧化作用進行體內外篩選，獲

3、得了數(shù)種具有較強抗氧化和免疫調節(jié)功能的植物，最終為延緩胸腺萎縮和免疫老化的控制提供新的思路和手段。 本研究完成的主要工作及其結果如下：一、小鼠胸腺增齡相關新基因IH-1的功能研究1、分析了IH-1基因的結構特點IH-1基因cDNA全長1001bp，含一個732bp的完整開放閱讀框(71～802)，編碼一個具有243個氨基酸、分子量約為28KD的蛋白質。我們首先利用SMART軟件進行結構域搜索，發(fā)現(xiàn)在IH-1基因編碼產物的第10～

4、114氨基酸處有一個RWD結構域，雖然該結構域的功能未見明確報道，但有分析資料顯示RWD結構域可能與細胞內的泛素-蛋白酶體代謝途徑有關。對蛋白質翻譯后修飾位點的預測結果表明，IH-1基因編碼蛋白具有糖基化修飾位點、SUMO序列修飾位點以及多個潛在的磷酸化修飾位點。 2、觀察了IH-1基因在胸腺及脾臟中的表達及分布為了確定IH-1基因在不同發(fā)育階段胸腺細胞和成熟T淋巴細胞中的表達水平，我們首先分離胸腺細胞和脾臟細胞，利用流式細胞分

5、選技術獲得各發(fā)育階段T淋巴細胞。隨后采用RT-PCR方法對IH-1基因的表達情況進行初步分析，結果表明CD4-CD8-雙陰性(DN)細胞和CD8+單陽性(SP)細胞中IH-1基因表達水平較高；而IH-1基因在CD4+CD8+雙陽性(DP)細胞和CD4+單陽性(SP)細胞中的表達水平較低；成熟T淋巴細胞中也有IH-1基因的表達。 3、利用酵母雙雜交技術，篩選到與IH-1基因編碼產物相互作用的蛋白分子，并對蛋白質間相互作用進行了驗證

6、我們構建了用于酵母雙雜交的1月齡小鼠胸腺pGADcDNA文庫，并以IH-1基因編碼產物全長作為“誘餌”蛋白對文庫進行了篩選，結果獲得兩個在酵母細胞中與IH-1基因編碼產物相互作用的蛋白分子：UbB(UbiquitinB)和Nedd8(Neuralprecursorcellexpressed，developmentallydown-regulatedgene8)。結合我們前期的酵母雙雜交實驗結果，我們初步認為IH-1基因編碼蛋白可能與Ub

7、B、Nedd8以及RACK1(Receptor1forActivatedC-Kinases)相互作用。 4、初步探討了IH-1基因編碼蛋白與NF-κB活性之間的關系我們采用NF-κB熒光素酶報告基因檢測技術，結果發(fā)現(xiàn)IH-1基因編碼蛋白能夠活化NF-κB，并且存在一定的劑量依賴關系。為了尋找該傳導通路的細胞外信號，我們用IL-1β進行細胞外刺激，結果表明IL-1β能增強IH-1基因編碼蛋白對NF-κB的活化作用，并且也有劑量依賴

8、性。 二、41種天然植物體內外抗氧化作用的研究 1、完成了41種天然植物體外抗氧化作用的研究 采用除羥基實驗、超氧陰離子生成抑制實驗、大鼠腹腔巨噬細胞呼吸爆發(fā)抑制實驗及DNA氧化損傷抑制實驗，對41種天然植物的抗氧化作用進行了體外篩選。結果發(fā)現(xiàn)多數(shù)植物具有不同程度的抗氧化作用，其中有13種植物在體外的抗氧化作用強于或相當于維生素C或維生素E，它們是水溶性植物兒茶素(Catechin)、茶多酚(Cathechin)

9、、綠茶(Greentea)、紅茶(Blacktea)、烏龍茶(Oolongtea)、丁香(Clove)、覆盆子(Bilberry)、葡萄籽(Grapeseed)和西伯利亞人參(Siberianginseng)；脂溶性植物銀杏(Ginkgo)、樹脂(Propolis)、迷迭香(Rosemary)和鼠尾草(Sage)。另外，我們將這些植物進行搭配組合(如丁香+覆盆子)，結果發(fā)現(xiàn)組合后的作用效果與單一植物的作用無顯著差異。 2、完成了

10、13種天然植物體內抗氧化及免疫調節(jié)功能的研究 在體外實驗基礎上，我們選擇出效果良好的13種植物，利用氧化應激小鼠模型研究這些植物在體內的抗氧化及免疫調節(jié)功能。結果發(fā)現(xiàn)，多數(shù)植物具有明顯的抗氧化及調節(jié)免疫作用，但是與維生素C或維生素E相比，其效果欠佳。結果如下：兒茶素、丁香、銀杏、茶多酚、烏龍茶、綠茶和樹脂具有較為穩(wěn)定的抗氧化及改善免疫功能的作用；覆盆子在體內能改善免疫功能，但其抗氧化效果相對較弱；丁香+覆盆子組方也表現(xiàn)出有效的抗

11、氧化和免疫保護作用；紅茶、迷迭香和鼠尾草也具有一定的抗氧化作用，但效果均較弱；西伯利亞人參在體內的作用效果較差可能與其增強機體代謝水平有關。 綜上，本研究產生以下結論：1)IH-1基因編碼蛋白可能作為信號傳導分子，在胸腺細胞內與泛素及泛素樣蛋白相互作用，通過泛素化代謝過程參與轉錄因子NF-κB的活化，從而促進胸腺細胞的分化發(fā)育。但是，IH-1基因增齡性表達下調的分子機理以及其與胸腺萎縮的關系仍有待進一步研究；2)篩選出數(shù)種兼具有