小鼠腭裂相關(guān)基因mcpr1功能的研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)室克隆的小鼠腭裂相關(guān)基因1(MouseCleftPalateRelatedgenel，簡(jiǎn)稱(chēng)mcprl)在2002年初被GenBank收錄并命名，其前期研究鑒定了mRNA全長(zhǎng)，初步建立了mcprl組織表達(dá)圖譜，并探討了這個(gè)基因在頜面部發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)，成功構(gòu)建了mcprl的綠色熒光真核表達(dá)載體，制備了mcprl多克隆抗體。但是，對(duì)mcprl的功能仍有許多未知之處，在本實(shí)驗(yàn)研究工作中，我們從該基因編碼蛋白MCPRl在小鼠胚胎發(fā)育

2、不同時(shí)期的表達(dá)變化；亞細(xì)胞定位；過(guò)表達(dá)與抑制表達(dá)對(duì)小鼠腭突間充質(zhì)細(xì)胞(MEPM)生物學(xué)特性的影響；mcprl與維甲酸(RA)的關(guān)系等方面對(duì)其功能做了初步的分析。為進(jìn)一步深入地研究該基因的功能和相應(yīng)蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。 方法：①mcprl在小鼠胚胎發(fā)育中的表達(dá)研究取妊娠12、14、18天的C57BL/6N近交系孕鼠引頸處死，取出胎鼠，置于40g/L多聚甲醛中4℃固定24h,胎鼠側(cè)面部朝下石蠟包埋，制備5μm厚連續(xù)切片。免疫組化檢測(cè)

3、，觀察mcprl的蛋白表達(dá)情況。②mcprl的亞細(xì)胞定位研究取妊娠第12.5天的C57BL/6N孕鼠引頸處死，在75％酒精中浸泡10s，無(wú)菌條件下取出胚胎，放在PBS中，在顯微鏡下分離腭突。用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度接近80％，0.25％胰酶消化，傳代。取第3代的細(xì)胞爬片，按免疫組化檢測(cè)試劑盒所示程序進(jìn)行免疫組化染色。以角蛋白、S-100蛋白和波形蛋白多克隆抗體為一抗，鑒定細(xì)胞來(lái)源。培養(yǎng)5代后用于

4、實(shí)驗(yàn)。提取MEPM細(xì)胞胞漿蛋白和胞核蛋白，采用本實(shí)驗(yàn)室制備的mcprl多克隆抗體，應(yīng)用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)mcprl在胞漿及胞核中的表達(dá)以進(jìn)行MCPR1蛋白的亞細(xì)胞定位。③mcprl對(duì)腭突間充質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響利用前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pEGFP-N3-mcprl及反義pEGFP-N3-mcprl真核表達(dá)載體，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法，按照invitrogen公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的方法用Lipofectamine2000TM將pEGFP-N3

5、-mcprl及反義pEGFP-N3-mcprl真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到MEPM細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)空載體轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-mcprl及反義pEGFP-N3-mcprl真核表達(dá)載體對(duì)MEPM細(xì)胞周期的影響。④mcprl與RA的關(guān)系將成功轉(zhuǎn)染了pEGFP-mpcrl正義載體和反義pEGFP-mpcrl載體的MEPM細(xì)胞72h后傳代入六孔板后，隨機(jī)分為RA誘導(dǎo)正義轉(zhuǎn)染組(A組)、R

6、A誘導(dǎo)反義轉(zhuǎn)染組(B組)、RA誘導(dǎo)未轉(zhuǎn)染組(C組)、正常對(duì)照組(D組)。各誘導(dǎo)組加入1×10-8mol/L濃度的ATRA(用無(wú)水乙醇稀釋)，對(duì)照組加入同等劑量的無(wú)水乙醇。MTT檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況；同時(shí)用Western-Blot法檢測(cè)MCPRl表達(dá)情況的改變；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。 結(jié)果：①免疫組化結(jié)果顯示MCPRl在小鼠胚胎多組織的發(fā)育中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，在E14時(shí)，Meckel軟骨內(nèi)有少數(shù)MCPRl陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，軟骨

7、周?chē)?yáng)性細(xì)胞較多；在E18，Meckel軟骨內(nèi)MCPRl陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞增多，且前部較后部多。②對(duì)提取的MEPM細(xì)胞胞漿蛋白和胞核蛋白進(jìn)行WesternBlot結(jié)果顯示在胞漿蛋白中MCPRl陽(yáng)性條帶明顯，而胞核蛋白中無(wú)明顯陽(yáng)性條帶。③MTT檢測(cè)結(jié)果顯示反義轉(zhuǎn)染組MEPM細(xì)胞增殖活性明顯高于正義轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示反義轉(zhuǎn)染組MEPM細(xì)胞處于S期、G2及M期的細(xì)胞比例明顯高于正義組及空白對(duì)照組，具有顯著差異。表明反義表達(dá)載

8、體轉(zhuǎn)染后處于DNA合成期及合成后期的細(xì)胞顯著增多。④MTT檢測(cè)結(jié)果顯示B組細(xì)胞增殖活性與D組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示B組處于S期、G2及M期的細(xì)胞比例與D組無(wú)顯著性差異。WesternBlot結(jié)果表明mcprl在RA誘導(dǎo)的A組及C組中表達(dá)較強(qiáng)，在B組中最弱。 結(jié)論：①推測(cè)mcprl在顱神經(jīng)嵴細(xì)胞成骨過(guò)程中可能以促PCD基因的身份在軟骨細(xì)胞的移行中發(fā)揮作用；在胚眼發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)變化提示mcprl可能在視泡的形成及

9、晶狀體等眼部結(jié)構(gòu)的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。②WesternBlot結(jié)果說(shuō)明mcprl的蛋白表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞漿，mcprl蛋白屬胞漿蛋白，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及前期實(shí)驗(yàn)原位雜交結(jié)果及細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果相一致。亞細(xì)胞定位的進(jìn)一步明確，為后續(xù)研究致畸劑如維甲酸作用下MEPM細(xì)胞內(nèi)mcprl的表達(dá)變化，以及封閉mcprl后MEPM細(xì)胞生物學(xué)行為的改變提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為進(jìn)一步研究該蛋白的功能打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。③通過(guò)pEGFP-N3-mcprl及反

10、義pEGFP-N3-mcprl真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染證明了mcprl的反義真核表達(dá)載體可以在蛋白水平有效的封閉mcprl的表達(dá)，表明反義真核表達(dá)載體封閉效果的可靠性，更為有意義的是顯示了mcprl的表達(dá)降低后，細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯增高，提示mcprl可能通過(guò)參與細(xì)胞凋亡等負(fù)反饋機(jī)制調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著相應(yīng)的作用。④轉(zhuǎn)染了反義pEGFP-N3-mcprl真核表達(dá)載體的MEPM細(xì)胞在RA誘導(dǎo)的條件其生物學(xué)特性未顯著變化，說(shuō)明