東亞鉗蝎蝎毒F(ab’)2抗體制備及其部分安全性及穩(wěn)定性評價研究.pdf

1、蝎毒為毒蛋白,主要為神經(jīng)毒,類似蛇毒液作用于中樞神經(jīng)及心肌,毒性比蛇毒輕。雖然蟄傷事件致死病例不多,但傷者往往患處劇痛。蝎傷者的臨床反應(yīng)主要是局部表現(xiàn)為大片狀紅腫、劇痛;全身癥狀于傷后2小時即可出現(xiàn),為神經(jīng)毒中毒癥狀,嚴(yán)重者可發(fā)生急性腎衰竭、呼吸肌、心肌麻痹而致死。偶有過敏性休克,嚴(yán)重者可致死亡。毒力較強的東亞鉗蝎(Buthus martensii Karsch,BMK)蟄傷還會使有的病人出現(xiàn)高血糖和尿糖,甚至引起胰腺炎。蝎蟄傷對兒童是

2、致命的。重度毒蝎蟄傷常發(fā)生于嬰幼兒,通常會引起呼吸短促,肺水腫、呼吸困難、視力模糊、吞咽困難、肌肉抽搐、行走障礙及其它肌肉運動共濟失調(diào)等癥狀,患者如不治療,死亡率較高。全球有很多國家報道蝎蟄傷,墨西哥是報道最多的國家之一,其全國范圍內(nèi)被毒蝎蟄傷事件達到20萬例,在某些地區(qū)毒蝎蟄傷比例居然高達2000例/10萬人口以上,被蟄傷人群70％以上為年齡不到10歲的兒童。近年來在我國河北等地陸續(xù)報道了多起蝎蟄傷病例,其中多起出現(xiàn)畏寒、發(fā)熱、抽搐、

3、休克等嚴(yán)重癥狀[1,2],也有被BMK蟄傷后致死的報道[3]。由于我國沒有蝎毒抗血清,因此對于蝎子蟄傷常采用西醫(yī)常規(guī)治療,存在治療時間長,患者恐懼、焦慮等問題,常并發(fā)腎衰等嚴(yán)重癥狀。目前對生物毒素中毒的治療抗血清仍是最有效的藥物,尤其是兒童被蝎蟄傷必須要用抗血清治療。如果能研制針對蝎毒的抗血清用于蝎子蜇傷的治療,那么將會大大縮短蝎蜇傷治療時間,降低蝎蜇傷的嚴(yán)重并發(fā)癥和致死率,為蝎蟄傷提供一種有效、快速的特異性治療藥物。
　　在蝎毒

4、抗血清的生產(chǎn)和研究中,目前依然是利用蝎全毒或純化后的神經(jīng)毒素免疫動物后制備。我國目前還未見利用蝎毒制備抗血清的研究報道。本研究首先采用小鼠腹腔和肌肉注射測定山西、山東、河南、遼寧等地產(chǎn)東亞鉗蝎蝎毒的半數(shù)致死劑量(LD50)。進一步選取山西產(chǎn)東亞鉗蝎毒作為免疫原,免疫馬匹進行蝎毒抗血清的制備,經(jīng)鹽析、酶解、加熱等步驟獲得F(ab’)2抗體,并以免疫擴散、ELISA和小鼠體外中和法分別測定超免血漿、純化的IgG及制備的F(ab’)2抗體對各

5、地產(chǎn)東亞鉗蝎蝎毒的抗體效價;并對所制備的抗血清的藥效學(xué)、部分安全性和穩(wěn)定性進行了評價。通過上述研究,為蝎蜇傷利用抗血清進行治療提供參考依據(jù)。
　　主要結(jié)果及結(jié)論如下:
　　1.采用小鼠腹腔注射和肌肉注射分別測定了我國主要東亞鉗蝎蝎毒LD50。結(jié)果顯示,山西產(chǎn)BMK的LD50為1.67mg.kg-1(腹腔)和2.06mg.kg-1(肌肉);山東產(chǎn)BMK的LD50為2.77mg.kg-1(腹腔)和2.63mg.kg-1(肌肉);

6、河南產(chǎn)BMK的LD50為2.92mg.kg-1(腹腔)和2.75mg.kg-1(肌肉);遼寧產(chǎn)BMK的LD50為10.77mg.kg-1(腹腔)和9.42mg.kg-1(肌肉)。
　　2.建立了山西產(chǎn)BMK制備馬源F(ab’)2抗體的方法。該抗體SDS-PAGE電泳純度為86.5%;免疫擴散檢測該抗體與山西產(chǎn)BMK毒素在0.4:1時出現(xiàn)明顯沉淀線,與山東、河南和遼寧產(chǎn)BMK毒素在0.1:1時均能出現(xiàn)明顯沉淀線。小鼠體外中和實驗表明

7、該抗體與山西產(chǎn)BMK蝎毒在2:1(M:M)時可保護小鼠100%存活,與遼寧產(chǎn)BMK蝎毒在0.5:1(M:M)時可保護小鼠100%存活,與山東和河南產(chǎn)BMK蝎毒在1:1(M:M)時可保護小鼠100%存活。
　　3.本實驗室條件下,凍干抗蝎毒抗體小鼠單次靜脈注射給藥最大耐受量為4000mg/kg.bw,相當(dāng)于臨床擬用劑量的934倍。
　　4.抗BMK蝎毒抗體進行體外溶血試驗,未引起溶血性反應(yīng)。
　　5.穩(wěn)定性結(jié)果表明,高溫

8、60℃、高濕92.5%士5%或75%±5%、強光照射條件下在短期內(nèi)對制備的抗BMK蝎毒抗體穩(wěn)定性和質(zhì)量無明顯影響。加速試驗表明三批樣品的模擬上市包裝在40℃±2℃、RH75%±5%條件下放置6個月,樣品穩(wěn)定。經(jīng)25℃長期留樣考察18個月,樣品的外觀、溶解性、pH值、含量和效價均未發(fā)現(xiàn)明顯變化。經(jīng)4℃長期留樣考察18個月,樣品的外觀、溶解性、pH值和效價均未發(fā)現(xiàn)明顯變化,F(ab’)2含量穩(wěn)定。
　　本研究為我國蝎蜇傷利用抗血清進行