雌激素對(duì)催產(chǎn)素興奮大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)作用的調(diào)節(jié)及其機(jī)制研究.pdf

1、催產(chǎn)素（Oxytocin，OT）經(jīng)典的生理作用是誘發(fā)子宮收縮和促進(jìn)泌乳。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明OT也參與調(diào)控胃腸道的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和免疫等功能。雖然關(guān)于OT影響胃腸道運(yùn)動(dòng)的報(bào)道已有很多，但是研究結(jié)果由于實(shí)驗(yàn)方法不同、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的差異以及研究腸道部位的不同而不盡相同。人類(lèi)胃腸道全程都有OT和OT受體的基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，說(shuō)明OT可能是一種胃腸激素，但消化道上何種細(xì)胞表達(dá)OT還沒(méi)有確定。 在女性，結(jié)腸功能紊亂非常常見(jiàn)，腸道功能也通

2、常會(huì)跟隨月經(jīng)周期而發(fā)生規(guī)律性改變。雖然有報(bào)道顯示其原因與女性體內(nèi)雌激素和孕激素周期性變化有關(guān)，但具體機(jī)制不清。雌激素可以上調(diào)子宮平滑肌和中樞內(nèi)的OT受體表達(dá)，從而增加這些臟器對(duì)OT的敏感性，但雌激素對(duì)消化道上的OT受體是否有相似的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。我們推測(cè)：生理周期中雌激素水平的波動(dòng)也會(huì)影響到大鼠結(jié)腸OT受體的敏感性和表達(dá)量，從而引起結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能的周期性變化。為了證實(shí)這個(gè)假設(shè)，我們采用監(jiān)測(cè)結(jié)腸腸道壓力和結(jié)腸肌條張力的方法分別在整體和離體水

3、平研究了OT對(duì)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的作用，并探討了雌激素對(duì)這種作用的影響；通過(guò)Western Blot和RT-PCR技術(shù)研究了雌激素對(duì)大鼠結(jié)腸OT受體蛋白和mRNA表達(dá)的影響，用免疫組化方法定位了大鼠結(jié)腸表達(dá)OT受體的細(xì)胞類(lèi)型。 材料和方法: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:實(shí)驗(yàn)采用健康成年雌性大鼠，部分大鼠接受雙側(cè)卵巢切除術(shù)（OVX），其余大鼠實(shí)驗(yàn)前不接受任何手術(shù)，根據(jù)大鼠所在的時(shí)段不同將大鼠分成三組：動(dòng)情前期、動(dòng)情期和動(dòng)情間期。 將體重200

4、-220克的雌性Wistar大鼠輕度乙醚麻醉，大鼠失去痛覺(jué)反射后，開(kāi)始手術(shù)。腹部剪毛并常規(guī)消毒，在左右下腹各做一厘米的切口，分離卵巢并切除，結(jié)扎子宮以止血?？p合肌層和皮膚并用碘伏消毒后將大鼠放回籠中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常更換消毒處理過(guò)的墊料。兩周后將OVX大鼠隨機(jī)分成四組：三組分別皮下注射不同劑量的雌激素（4，25，100μg kg-1，s．c．）作為處理組；一組注射芝麻油作為對(duì)照組。每天注射一次連續(xù)注射六天，最后一次注射24小時(shí)后開(kāi)始實(shí)

5、驗(yàn)。陰道分泌物涂片法分辨正常雌性大鼠的生理周期。 子宮重量和血清雌激素水平的測(cè)定:將大鼠斷頭犧牲，取出子宮并稱(chēng)重，迅速取血，將全血放入離心機(jī)中3000轉(zhuǎn)離心30分鐘以分離血漿，將血漿放入4℃冰箱保存。血漿雌激素水平使用自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)量。 離體肌條的制備和張力監(jiān)測(cè):大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12小時(shí)，自由飲水?？焖贍奚笫?，迅速取出遠(yuǎn)端結(jié)腸（距離肛門(mén)5-7 cm），放置在充滿(mǎn)柯氏液的培養(yǎng)皿中，持續(xù)供給含95％氧氣和5％二氧

6、化碳的混合氣體。在培養(yǎng)皿中將結(jié)腸沿腸系膜方向剪開(kāi)，并沿與縱行平滑肌纖維平行的方向取出結(jié)腸遠(yuǎn)端縱行肌肌條（8×3 mm），展開(kāi)平鋪于培養(yǎng)皿中，用清潔圖釘固定。將各個(gè)肌條分別安置于灌流肌槽中，每個(gè)肌槽中均盛有5 ml37℃Krebs液并持續(xù)供給95％O2和5％CO2混合氣體。肌條的一端固定在肌槽底部的玻璃掛鉤上，另一端連接張力換能器（JH-2B，成都設(shè)備公司，中國(guó)成都），肌肉張力信號(hào)在生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)（SMUP-PC，上海嘉龍教學(xué)儀器廠(chǎng)

7、，中國(guó)上海）上記錄及分析。肌條在1 g的前負(fù)荷下孵育45-min-60 min（每隔10 min用新鮮37℃Krebs液沖洗肌條），待肌條自發(fā)收縮活動(dòng)平穩(wěn)后加入不同濃度的OT，觀(guān)察肌條收縮情況的變化。 在體實(shí)驗(yàn)中大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的監(jiān)測(cè):腹腔注射異戊巴比妥鈉麻醉大鼠，并將其固定在恒溫手術(shù)臺(tái)上，給予氣管插管和股動(dòng)脈插管，以保證大鼠呼吸通暢和監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓。將固定在塑料管上的氣囊涂上石蠟油之后插入大鼠結(jié)腸，塑料管的另一端連接壓力換能器（YP

8、-101；新航興業(yè)科技公司，中國(guó)北京）。壓力變化經(jīng)過(guò)生物信號(hào)放大器（ML136；埃德儀器有限公司，悉尼，澳大利亞）放大后，通過(guò)多導(dǎo)生物記錄儀（Powerlab8SP；埃德儀器有限公司，悉尼，澳大利亞）進(jìn)行記錄和分析。氣囊內(nèi)沖入水大約0．7 ml，使囊內(nèi)壓力維持在10mmHg左右，待40min后結(jié)腸壓力穩(wěn)定靜脈注射各種試劑，觀(guān)察結(jié)腸壓力的變化。 犧牲大鼠后取出約1cm長(zhǎng)的遠(yuǎn)端結(jié)腸，勻漿并提取蛋白質(zhì)。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白

9、質(zhì)，轉(zhuǎn)膜。PVDF膜經(jīng)過(guò)一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育一小時(shí)，最后加入ECL kit顯影。 犧牲大鼠后取出約1cm長(zhǎng)的遠(yuǎn)端結(jié)腸，trizol內(nèi)勻漿并提取RNA。按照ABI反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增引物購(gòu)自Invitrogen公司。 免疫組織化學(xué): OVX大鼠皮下注射不同劑量的雌激素或芝麻油六天后犧牲，取出遠(yuǎn)端結(jié)腸，柯氏液清洗后將組織放入4％多聚甲醛固定過(guò)夜，第二天自來(lái)水流水沖洗1小時(shí)。經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟

10、、包埋。待蠟成型后進(jìn)行組織切片，厚度為4um，一抗4℃孵育過(guò)夜；二抗孵育30 min。山羊抗OTR多克隆抗體，兔抗山羊抗體（二抗）購(gòu)自生物晶美。采用DAB顯色劑使免疫陽(yáng)性細(xì)胞顯色。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:指標(biāo)變化用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，用單因素方差分析檢驗(yàn)加入OT后不同時(shí)間段結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的變化，以P<0．05為顯著性差異界值。 結(jié)果： 1．雌激素（4-100μg/kg/天×6天）可以劑量依賴(lài)性的提高血漿雌激素水

11、平和子宮重量。OT興奮雌性大鼠在體和離體大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，雌激素處理后大鼠結(jié)腸對(duì)催產(chǎn)素敏感性明顯強(qiáng)于對(duì)照組。 2．大鼠的動(dòng)情周期中，動(dòng)情前期和動(dòng)情期的雌激素水平高于動(dòng)情間期，與此相對(duì)應(yīng)，大鼠處于動(dòng)情前期和動(dòng)情期時(shí)，相同劑量的催產(chǎn)素對(duì)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的興奮作用明顯強(qiáng)于動(dòng)情間期。 3．靜脈注射催產(chǎn)素特異性受體阻斷劑atosiban后再給予OT，OT興奮結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的作用受到明顯抑制。 4．電壓依賴(lài)性Na+離子通道阻斷劑TTX完全阻斷

12、了催產(chǎn)素對(duì)遠(yuǎn)端結(jié)腸縱行肌的興奮作用。 5．靜脈注射加壓素引起結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的抑制，與OT的作用相反。 6．雌激素明顯提高OVX大鼠結(jié)腸的OT受體蛋白和mRNA的表達(dá)水平。 7．免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)催產(chǎn)素受體在肌間神經(jīng)叢中表達(dá)，經(jīng)過(guò)雌激素處理的OVX大鼠結(jié)腸OT受體免疫陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多。 結(jié)論: 1．OT通過(guò)腸神經(jīng)叢上的OT受體興奮雌性大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸的運(yùn)動(dòng)。 2．雌激素上調(diào)大鼠結(jié)腸對(duì)OT的敏感性，這種作