青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸椎間盤(pán)軟骨終板蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、研究背景：青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS)是一種脊柱三維畸形，當(dāng)青少年脊出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性側(cè)凸(冠狀面X線平片上Cobb角>10℃，合并脊柱的旋轉(zhuǎn)畸形)，而無(wú)其他器質(zhì)性疾病時(shí)，可以臨床上診斷此疾病。AIS是兒童及青少年骨骼肌肉系統(tǒng)最常見(jiàn)的畸形之一。正如它命名中“特發(fā)性”所指，盡管學(xué)者們做了大量研究，但迄今為止它的病因仍然不明，這就給它的早期干預(yù)、早期治療帶來(lái)了一定困難。 盡管AIS的發(fā)病原因尚不清楚，但經(jīng)過(guò)多年的研究，一些科學(xué)家或科研機(jī)構(gòu)

2、一經(jīng)提出了可能與脊柱側(cè)凸發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的一些假說(shuō)：如家族遺傳因素學(xué)說(shuō)，生長(zhǎng)發(fā)育學(xué)說(shuō)和結(jié)締組織異常學(xué)說(shuō)等諸多觀點(diǎn)問(wèn)世，但各種論點(diǎn)所得出的結(jié)論都不能很好地進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。所以大部分學(xué)者認(rèn)為，AIS是一個(gè)涉及多遺傳易感基因位點(diǎn)和多系統(tǒng)致病環(huán)節(jié)，引發(fā)多種損害效應(yīng)的蛋白質(zhì)分子表達(dá)異常的疾病。單基因和單一蛋白質(zhì)分子的研究已經(jīng)進(jìn)入了一條無(wú)法繼續(xù)前行的死胡同。從脊柱側(cè)凸病因?qū)W的報(bào)告文獻(xiàn)中可以發(fā)現(xiàn)，近五年來(lái)已經(jīng)沒(méi)有新的觀點(diǎn)或發(fā)現(xiàn)問(wèn)世。 椎間盤(pán)不對(duì)

3、稱(chēng)是引起AIS畸形產(chǎn)生和進(jìn)展的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。從解剖學(xué)和影像學(xué)檢查中不難發(fā)現(xiàn)，凸側(cè)椎間盤(pán)的發(fā)育較凹側(cè)明顯成熟。從解剖學(xué)和影像學(xué)檢查中不難發(fā)現(xiàn)，凸側(cè)椎間盤(pán)的發(fā)育較凹側(cè)明顯成熟。椎間盤(pán)由纖維環(huán)環(huán)繞凝膠狀的髓核及覆蓋于此結(jié)構(gòu)的上下軟骨終板組成。軟骨終板通常厚度不到1mm，由透明軟骨組成，它將椎體和間盤(pán)纖維環(huán)及髓核隔開(kāi)。椎間盤(pán)作為人體內(nèi)最大的無(wú)血管組織，除纖維環(huán)外圍極少數(shù)幾層環(huán)狀纖維板通過(guò)臨近血管進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)代謝外，其余椎間盤(pán)組織則需要通過(guò)軟骨終板的彌散

4、作用完成營(yíng)養(yǎng)獲取和代謝物的排出。Driscoll M等研究發(fā)現(xiàn)椎間盤(pán)的不均衡發(fā)育程度和AIS的進(jìn)展呈正相關(guān)；另外，與Lonstein JE的結(jié)論相同，并且通過(guò)比較凸、凹側(cè)椎間盤(pán)差異的大小可以預(yù)測(cè)AIS患者側(cè)凸畸形的進(jìn)展速度和畸形所能達(dá)到的嚴(yán)重程度。 研究發(fā)現(xiàn)，凸、凹側(cè)脊柱軟骨終板的細(xì)胞活動(dòng)和組織成熟度差異有可能影響脊柱側(cè)凸的進(jìn)展。組織學(xué)研究表明，側(cè)彎頂椎凸、凹側(cè)軟骨終板的細(xì)胞活動(dòng)和組織成熟度存在明顯的差異。在脊柱后凸畸形和側(cè)凸畸

5、形的患者中，能夠觀察到椎間盤(pán)出現(xiàn)形明顯的態(tài)學(xué)上變化。其中最為引入注目的一點(diǎn)就是在脊柱側(cè)凸患者的軟骨終板內(nèi)不同程度異常鈣化的出現(xiàn)。這種鈣化的通常由細(xì)胞的兩極開(kāi)始出現(xiàn)，逐漸環(huán)繞整個(gè)細(xì)胞，進(jìn)而擴(kuò)散至到細(xì)胞外基質(zhì)。這種異常鈣化影響了椎間盤(pán)組織的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和物質(zhì)代謝，進(jìn)而可能影響椎間盤(pán)的生長(zhǎng)和發(fā)育。 AIS脊柱畸形通常開(kāi)始于青春期患者生長(zhǎng)發(fā)育起始階段，而此前并未出現(xiàn)脊柱的側(cè)凸畸形及椎間盤(pán)的不對(duì)稱(chēng)生長(zhǎng)。在由正常—異常的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，側(cè)凸部位

6、的椎間盤(pán)和終板的必然發(fā)生了某些變化。蛋白質(zhì)作為生物生理功能過(guò)程中最重要的一類(lèi)分子，必然會(huì)在這種變化中發(fā)揮重要的作用。近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展為AIS的研究帶來(lái)了新的動(dòng)力。通過(guò)對(duì)比不同組織樣品中的蛋白質(zhì)組，可以直觀地了解二者之間在分子水平上有何不同。 研究目的： 1.分別鑒定凸側(cè)和凹側(cè)椎間盤(pán)軟骨終板的蛋白質(zhì)組。 2.比較二者之間的差異。 3.嘗試尋找引起椎間盤(pán)不對(duì)稱(chēng)發(fā)育的關(guān)鍵蛋白。 研究方法：

7、 1.研究對(duì)象： 根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)確定2006年7月—2007年8月期間北京協(xié)和醫(yī)院脊柱外科收治并確診的6例青少年脊柱側(cè)凸(AIS)患者。 2.技術(shù)方法： ·側(cè)凸頂點(diǎn)軟骨終板組織獲取和處理：通過(guò)前路脊柱側(cè)凸矯形手術(shù)，手術(shù)醫(yī)師在術(shù)中完整取得側(cè)凸頂點(diǎn)軟骨終板；去除軟骨組織表面附著的纖維環(huán)和骨組織，充分清洗確保無(wú)血細(xì)胞殘留。 ·軟骨組織蛋白質(zhì)提取：使用組織切片、洗脫、蛋白質(zhì)沉淀技術(shù)直接獲取軟骨組織蛋白

8、質(zhì)。 ·測(cè)定蛋白質(zhì)濃度并進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)樣品電泳分析。 ·質(zhì)譜分析：使用二維液相色譜串聯(lián)電噴霧離子阱質(zhì)譜(2D—LC—LTQ)技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析。 ·數(shù)據(jù)處理：質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用SEQUEST對(duì)humanref蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Version9.18)進(jìn)行解讀，并用Bioworks3.2將結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾，分類(lèi)和顯示。由SwissProt和TrEMBL蛋白庫(kù)的搜索結(jié)果給蛋白標(biāo)注上名稱(chēng)。 研究結(jié)果：

9、 ·軟骨組織中獲得的平均蛋白質(zhì)濃度為3.02mg/ml(2.20-3.97mg/ml)。 ·聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳(SDS-PAGE)發(fā)現(xiàn)，凸側(cè)蛋白質(zhì)樣品在蛋白質(zhì)總量和種類(lèi)二方面均較凹側(cè)蛋白樣品顯著增加。 ·凸側(cè)樣品鑒定出103種蛋白，凹側(cè)鑒定出55種蛋白，其中凸、凹側(cè)共有的蛋白45種，凸側(cè)特有蛋白58種，凹側(cè)特有蛋白10種。 ·在凸側(cè)發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)至少3種具有促進(jìn)細(xì)胞和組織成熟、分化功能的蛋白質(zhì)；而凹側(cè)特有