氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞過程中DNA損傷及DNA修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)的研究.pdf

1、鎘及其化合物是常見的工業(yè)毒物和環(huán)境污染物，研究證實(shí)鎘可以誘發(fā)多種腫瘤，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)早在1993年就將其歸類為第一類致癌物。近年來，對于鎘毒作用機(jī)制的研究取得了很大進(jìn)展，但其致癌的機(jī)制仍未完全闡明。 癌癥的發(fā)生發(fā)展是內(nèi)外環(huán)境因素導(dǎo)致的涉及多階段和多種基因改變的復(fù)雜過程，這些基因的改變往往又與機(jī)體內(nèi)遺傳因素和環(huán)境致癌因素的長期累積性損傷作用有關(guān)。DNA損傷、修復(fù)、復(fù)制、耐受和逃逸機(jī)制與基因突變和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化具有十分密

2、切的內(nèi)在聯(lián)系，其中DNA修復(fù)基因在維持基因組的穩(wěn)定性和完善性中起著關(guān)鍵的作用。DNA修復(fù)基因表達(dá)的下調(diào)和突變都會影響細(xì)胞的DNA修復(fù)功能，從而極易導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。DNA修復(fù)系統(tǒng)劃可分為堿基剪切修復(fù)(BER)、核苷酸切除修復(fù)(NER)、錯配修復(fù)(刪R)、直接修復(fù)和雙鏈斷裂修復(fù)。它們分別參與一個或多個修復(fù)途徑，其中與細(xì)胞轉(zhuǎn)化及癌變關(guān)系較為密切的修復(fù)途徑包括O<'6>-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)、MMR、NER和BER途徑，而h

3、MSH2、hMLH1、ERCC1、ERCC2、XRCC1、hOGG1、MGMT等7種基因是以上四個DNA修復(fù)途徑的關(guān)鍵基因，可反映DNA修復(fù)系統(tǒng)的能力。這些DNA修復(fù)基因的異常，是導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要原因。目前DNA修復(fù)基因已被作為侯選癌癥易感性基因。 為了深入研究DNA損傷、DNA修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)及其突變情況在鎘分子致癌機(jī)制中的作用，本課題運(yùn)用多種先進(jìn)的分子生物學(xué)手段檢測了氯化鎘誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)惡性轉(zhuǎn)化過程

4、中DNA損傷及7種DNA修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)情況，并對異常表達(dá)的DNA修復(fù)基因作外顯子序列分析，這對進(jìn)一步闡明鎘的分子致癌機(jī)制有重要作用，并為高危人群的篩選和相關(guān)腫瘤的早期生物檢測指標(biāo)提供新的依據(jù)。 方法: 1、鎘轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞中DNA損傷檢測鎘惡性轉(zhuǎn)化人支氣管上皮模型已于前期研究建立并公開發(fā)表。對非轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞、氯化鎘誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化16HBE第15代和35代細(xì)胞及其接種裸鼠成瘤的16HBE細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳(

5、SCEG)，以DNA損傷率和彗星尾長分析四種細(xì)胞的DNA損傷情況。 2、DNA修復(fù)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平分析通過對非轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞、氯化鎘轉(zhuǎn)化16HBE第5代、第15代、第35代細(xì)胞及其接種裸鼠成瘤的16HBE細(xì)胞進(jìn)行總 RNA 抽提，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，以β-Actin作為內(nèi)參照對照，半定量檢測hMSH2、hMLH1、ERCC1、ERCC2、XRCC1、hOGG1和MGMT共7種DNA修復(fù)相關(guān)基因的

6、mRNA表達(dá)水平。 3、DNA修復(fù)相關(guān)基因蛋白表達(dá)的動態(tài)觀察通過對非轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞、氯化鎘誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化16HBE第5代、第15代、第35代細(xì)胞及其接種裸鼠成瘤的16HBE細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)(SP法)實(shí)驗(yàn)，檢測hMSH2、hMLH1、ERCC1、ERCC2、XRCC1、hOGG1、MGMT等7種DNA修復(fù)基因蛋白表達(dá)的動態(tài)變化情況。 4、DNA修復(fù)基因外顯子的序列檢測對非轉(zhuǎn)化16HBE對照細(xì)胞及其鎘轉(zhuǎn)化成瘤細(xì)胞進(jìn)行D

7、NA抽提，對異常表達(dá)的DNA修復(fù)基因的10個外顯子 (hMSH2exon6、hMSH2 Exon7、hMSH2Exon8、hMSH2Exon9、hMSH2 exon12、ERCC1 exon3、ERCC1 exon4、XRCC1 exon6、XRCC1 exon9、hOGG1 exon7)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因序列測定，檢測各外顯子的突變情況。 5、統(tǒng)計學(xué)方法運(yùn)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫，計數(shù)資料的

8、描述用率表示，各率的比較用 x<'2>檢驗(yàn)，計量資料的統(tǒng)計描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個樣本均數(shù)的比較用單因素方差分析(ANOVA)，多個樣本均數(shù)與對照組均數(shù)比較用Dunnett-t 檢驗(yàn)。 結(jié)果: 1、氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞過程中對DNA的損傷作用用單細(xì)胞凝膠電泳(SCEG)檢測鎘惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞過程中DNA的損傷情況。結(jié)果顯示，氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化16HBE第15代、第35代細(xì)胞和氯化鎘誘發(fā)16HBE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞

9、接種裸鼠成瘤細(xì)胞的DNA損傷率分別達(dá)22.00％、46.75％和49.00％，明顯高于非轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞的4.75％損傷率(P<0.001)，三種細(xì)胞彗星平均尾長也顯著大于非轉(zhuǎn)化的16HBE細(xì)胞(P<0.001)，提示鎘化物可導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷。 2、鎘轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞中DNA修復(fù)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)各實(shí)驗(yàn)細(xì)胞總RNA經(jīng)兩步法RT-PCR擴(kuò)增后獲得各DNA修復(fù)相關(guān)基因cDNA目的產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)掃描各DNA修改相關(guān)基因

10、和β-Actin電泳條帶。結(jié)果顯示，隨著CdCl<,2>對16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)化代數(shù)增加，hMSH2、ERCC1、XRCC1和hOGG1基因mRNA表達(dá)水平表達(dá)逐漸減弱，與非轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞相比，CdCl<,2>惡性轉(zhuǎn)化第35代細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種裸鼠成瘤細(xì)胞的hMSH2、ERCC1、XRCC1和hOGG1基因mRNA表達(dá)水平均有不同程度的降低(P<0.05)。而MGMT基因、hMLH1基因和ERCC2基因mRNA表達(dá)水平在氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化1

11、6HBE細(xì)胞過程中未見顯著性差異(P>0.05)。提示某些DNA修復(fù)基因表達(dá)水平與鎘的細(xì)胞轉(zhuǎn)化及致癌性相關(guān)。 3、DNA修復(fù)相關(guān)基因蛋白表達(dá)的動態(tài)變化經(jīng)過免疫組織化學(xué)(SP法)檢測，DNA修復(fù)相關(guān)基因蛋白hMSH2、ERCC1、XRCC1和hOGG1在16HBE細(xì)胞和氯化鎘第5代轉(zhuǎn)化細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)，隨著CdCl<,2>對16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)化代數(shù)增加，其表達(dá)逐漸減弱，至第35代細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種裸鼠成瘤細(xì)胞均呈現(xiàn)陰性表達(dá)。另外3

12、個DNA修復(fù)相關(guān)基因MGMT、hMLH1和ERCC2在16HBE細(xì)胞和氯化鎘第5代細(xì)胞、第15代細(xì)胞、第35代細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種裸鼠成瘤細(xì)胞均呈陽性表達(dá)。提示某些DNA修復(fù)基因蛋白的表達(dá)下調(diào)與鎘的細(xì)胞轉(zhuǎn)化及其致癌性有關(guān)。 4、異常表達(dá)的DNA修復(fù)相關(guān)基因突變情況對異常表達(dá)的DNA修復(fù)基因外顯子進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示非轉(zhuǎn)化16HBE對照細(xì)胞各基因外顯子序列均與Genbank報道的序列一致，但在鎘轉(zhuǎn)化成瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)hMSH2基因e

13、xon8在第1、2、7位點(diǎn)上均出現(xiàn)胸腺嘧啶T缺失，hMSH2基因exon9在第20和第182位點(diǎn)出現(xiàn)腺嘌呤A缺失，hMSH2基因exon12在241位點(diǎn)上出現(xiàn)腺嘌呤A插入，ERCC1基因exon4在第1位點(diǎn)出現(xiàn)腺嘌呤A缺失，hOGG1基因exon7在第162位點(diǎn)插入一個腺嘌呤A，所有的突變均為移碼突變。其余在氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞過程中異常表達(dá)的DNA修復(fù)相關(guān)基因的各外顯子序列與對照組相比未見差異。提示DNA修復(fù)相關(guān)基因的突變可能

14、與某些基因的表達(dá)異常有聯(lián)系。 結(jié)論: 1、氯化鎘對16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，可見細(xì)胞DNA明顯損傷，發(fā)現(xiàn)多種DNA修復(fù)相關(guān)基因hMSH2、ERCC1、XRCC1和hOGG1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，其表達(dá)水平隨著鎘對16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化程度而不斷減弱，表明細(xì)胞DNA損傷及DNA修復(fù)能力下降可能是鎘化物分子致癌的重要機(jī)制。 2、在氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞過程中，hMSH2、ERCC1和hOGG1基因的