ATRA耐藥相關(guān)新基因HA117作用、機(jī)制及其臨床意義研究.pdf

1、第一部分HA117在急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60、NB4中耐藥作用及其機(jī)制的體外實驗研究
　　目的:采用重組腺病毒介導(dǎo)的基因高表達(dá)技術(shù)，評價新基因HA117在兩種人急性髓系白血病(AML)細(xì)胞株HL-60和NB4中的功能性表達(dá)。通過研究HA117對這兩種細(xì)胞株ATRA及多種化療藥物耐藥的影響，研究HA117的功能作用。通過研究HA117對HL-60和NB4細(xì)胞周期、增殖、凋亡的影響，并從細(xì)胞功能形態(tài)學(xué)上闡明其可能作用機(jī)制;通過檢

2、測HA117與作用路徑可能相關(guān)的關(guān)鍵基因蛋白: PML-RARα、RARα、Bcl-2、Caspase3、MDR1(P-gp)、MRP1及LRP的相互關(guān)系，從分子水平上闡明其作用機(jī)制。為進(jìn)一步研究HA117基因在SCID小鼠白血病動物模型體內(nèi)的耐藥作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:(1)采用乒乓交互感染法，以人胚腎細(xì)胞株HEK293細(xì)胞為包裝細(xì)胞，收集并濃縮攜帶綠色熒光蛋白及HA117的重組腺病毒（Ad-GFP-HA117）和攜帶綠

3、色熒光蛋白的空載體重組腺病毒(Ad-GFP);(2)采用濃縮病毒轉(zhuǎn)染法，建立HA117基因高表達(dá)的實驗組細(xì)胞，以倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后HL-60和NB4的綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)的表達(dá)情況;(3)流式細(xì)胞儀技術(shù)（flow cytometry, FCM）檢測不同病毒滴度(multiplicity ofinfection，MOI)下Ad-GFP-HA117和Ad-GFP對HL-60和NB

4、4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，胎盤藍(lán)染色法檢測不同MOI下對應(yīng)實驗細(xì)胞的存活率，篩選出最適MOI;(4) Real time PCR和Western blot技術(shù)從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平檢測外源性HA117在兩種細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染后的表達(dá)情況;(5)瑞氏染色觀察HA117對ATRA誘導(dǎo)HL-60、NB4細(xì)胞向正常粒系成熟細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)變化的影響;(6) NBT還原能力實驗檢測HA117對ATRA誘導(dǎo)HL-60、NB4細(xì)胞向正常粒系成熟細(xì)胞分化時還原功能的

5、影響;(7) FCM檢測HA117對ATRA誘導(dǎo)HL-60、NB4細(xì)胞凋亡的影響;(8)藥物敏感實驗檢測HA117轉(zhuǎn)染后的兩種白血病細(xì)胞對多種臨床常用化療藥物的耐受能力的影響;(9) MTT法檢測HA117對HL-60和NB4細(xì)胞增殖能力的影響;(10)流式細(xì)胞儀檢測HA117對HL-60和NB4細(xì)胞周期的影響;(11) Real time PCR及Western blot法檢測HA117對ATRA及其他化療藥物多藥耐藥作用可能相關(guān)mR

6、NA和蛋白:PML-RARα、RARα、Caspase3、Bcl-2、MDR1(P-gp)、MRP1和LRP表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果:(1)擴(kuò)增收集獲得足量實驗應(yīng)用的的重組腺病毒液，感染滴度為3.2×109 PFU/mL;(2)重組腺病毒Ad-GFP-HA117成功轉(zhuǎn)染入了HL-60和NB4實驗細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染后48h檢測不同MOI對應(yīng)實驗細(xì)胞的存活率和感染率。當(dāng)MOI為100時最適腺病毒轉(zhuǎn)染率約為30％-40％，細(xì)胞存活率大于80

7、％，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率高、存活率高、存活狀態(tài)良好，可繼續(xù)后期實驗;(3) Real time PCR和Western blot法證實Ad-GFP-HA117轉(zhuǎn)染后外源性HA117能在基因和蛋白水平于兩種實驗白血病細(xì)胞株中明顯高表達(dá);(4)瑞氏染色法結(jié)果顯示，HA117阻滯了ATRA誘導(dǎo)HL-60和NB4細(xì)胞向正常粒細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)變化;(5)NBT還原實驗證實HA117阻滯了ATRA誘導(dǎo)HL-60和NB4細(xì)胞向正常粒系白細(xì)胞分化后所具有的還原功

8、能;(6) FCM檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，HA117阻滯了ATRA誘導(dǎo)HL-60和NB4細(xì)胞的凋亡;(7)藥物敏感性實驗結(jié)果證實，轉(zhuǎn)染HA117的兩種白血病細(xì)胞株較未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空腺病毒載體組細(xì)胞株對臨床常用化療藥物的耐受性顯著提高，分別增高了2.5～10倍（P＜0.05或P＜0.01）;(8) MTT法細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，外源性HA117的轉(zhuǎn)染對HL-60和NB4細(xì)胞的增殖能力無影響;(9) FCM檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，外源性HA117

9、的表達(dá)對兩種白血病細(xì)胞株的細(xì)胞周期無影響;(10)HA117對PML-RARα、RARα、Caspase3、MDR1(P-gp)、MRP1、LRP基因及蛋白的表達(dá)的無明顯影響，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。HA117對Bcl-2有上調(diào)作用，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:重組腺病毒技術(shù)可以有效地將外源性人HA117基因高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染入實驗細(xì)胞HL-60和NB4內(nèi)。HA117在白血病細(xì)胞株HL-60和NB4中具有A