高仿真組織工程神經(jīng)修復(fù)材料的制備及應(yīng)用研究.pdf

1、周圍神經(jīng)再生和功能修復(fù)是尚未解決的臨床難題。對(duì)于短節(jié)段的神經(jīng)損傷，可以將斷裂的神經(jīng)直接對(duì)端吻合，使近端再生的神經(jīng)纖維能長入遠(yuǎn)端。但對(duì)于長節(jié)段的神經(jīng)缺損，臨床上無法進(jìn)行無張力縫合，目前治療的金標(biāo)準(zhǔn)是將未損傷區(qū)域的自體神經(jīng)移植到損傷區(qū)域來橋接損傷的神經(jīng)斷端。然而，應(yīng)用自體神經(jīng)移植受到很多因素限制：獲取供體神經(jīng)需要二次手術(shù)，供區(qū)神經(jīng)來源不足，繼發(fā)的供區(qū)神經(jīng)功能喪失，以及供受神經(jīng)在組織結(jié)構(gòu)和尺寸上不匹配等。因此，研發(fā)能夠有效代替自體神經(jīng)的移植替

2、代物是目前亟待解決的難題。
　　近年來，組織工程周圍神經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。應(yīng)用組織工程學(xué)方法制備組織工程移植物橋接長節(jié)段神經(jīng)缺損收到較好療效，受到了越來越多的關(guān)注。組織工程移植物一般由生物支架材料、種子細(xì)胞和生物活性因子三部分構(gòu)成。其中支架作為種子細(xì)胞和神經(jīng)營養(yǎng)因子的載體，作為組成神經(jīng)損傷修復(fù)微環(huán)境的主體，其構(gòu)建和性能改進(jìn)研究成為制約周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的關(guān)鍵。支架材料的組成及內(nèi)部微結(jié)構(gòu)是影響組織工程移植物修復(fù)長節(jié)段神經(jīng)損傷的關(guān)鍵因素。

3、最近研究表明，內(nèi)部具有定向微結(jié)構(gòu)的支架，在橋接神經(jīng)缺損時(shí)比無定向結(jié)構(gòu)的支架更有利于引導(dǎo)再生軸突的定向生長，能夠促進(jìn)再生神經(jīng)纖維通過損傷區(qū)到達(dá)遠(yuǎn)端，證實(shí)了支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)的物理引導(dǎo)作用對(duì)于神經(jīng)再生的重要性。分析原因，主要是因?yàn)槠鋬?nèi)部定向結(jié)構(gòu)模擬了正常神經(jīng)基底膜的軸向微管結(jié)構(gòu)。但這些支架材料在原料組成以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)上，與自體神經(jīng)神經(jīng)基底膜的組成和結(jié)構(gòu)還有很大差距，需要進(jìn)一步改進(jìn)。
　　鑒于正常神經(jīng)基底膜微管結(jié)構(gòu)引導(dǎo)再生神經(jīng)軸突定向生長的關(guān)鍵

4、作用，如能夠根據(jù)神經(jīng)組織的真實(shí)組成和結(jié)構(gòu)來選擇和制備組織工程支架，將能夠在一定程度上使該支架具備類似正常神經(jīng)組織的特性，有可能會(huì)獲得最理想的移植替代修復(fù)結(jié)果。然而，到目前為止，僅有少數(shù)具有類似結(jié)構(gòu)的支架被報(bào)道，而應(yīng)用其在體內(nèi)修復(fù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長節(jié)段周圍神經(jīng)缺損至今未見研究報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)中，選用神經(jīng)基底膜基質(zhì)材料——膠原為支架的主要原料，應(yīng)用改良的梯度冷凍干燥技術(shù)，制備具有軸向微管結(jié)構(gòu)的三維多孔支架材料。該支架在組成及內(nèi)部結(jié)構(gòu)方面高度

5、仿真正常神經(jīng)基底膜。隨后，從原料配比、冰醋酸濃度以及冷淋速度等三方面對(duì)改良的梯度冷凍干燥技術(shù)工藝進(jìn)行對(duì)比研究，篩選出最佳的制備工藝指標(biāo)。為了使支架能夠滿足體內(nèi)移植的需求，應(yīng)用新型低細(xì)胞毒性交聯(lián)劑——京尼平對(duì)支架進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，改善其機(jī)械強(qiáng)度和降解速度，并確定其最佳交聯(lián)參數(shù)。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)國家醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)和要求，對(duì)本支架進(jìn)行細(xì)胞相容性和組織相容性評(píng)價(jià)，結(jié)果證實(shí)本支架材料具有良好的生物安全性，可用于體內(nèi)移植修復(fù)。最后，應(yīng)用免疫組

6、織學(xué)、透射電鏡、神經(jīng)電生理、逆行示蹤技術(shù)以及評(píng)測(cè)坐骨神經(jīng)指數(shù)等方法，從形態(tài)學(xué)和功能學(xué)兩方面綜合評(píng)價(jià)本支架橋接大鼠坐骨神經(jīng)15mm缺損的修復(fù)效果，結(jié)果證實(shí)其療效接近自體神經(jīng)移植。具體內(nèi)容如下：
　　第一部分支架材料制備及最佳制備工藝參數(shù)確定
　　目的：構(gòu)建組成及結(jié)構(gòu)高度仿真的組織工程神經(jīng)支架
　　方法：以細(xì)胞外基質(zhì)主要成分——膠原為原料，應(yīng)用改良的梯度冷凍干燥技術(shù)制備仿真支架，掃描電鏡觀察其結(jié)構(gòu)，評(píng)測(cè)支架孔徑、孔隙率等基

7、本性能，優(yōu)化其制備參數(shù)。
　　結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)制備的支架材料在組成及內(nèi)部結(jié)構(gòu)方面高度仿真正常神經(jīng)基底膜，具備以下優(yōu)點(diǎn)：長軸定向微管樣仿生三維結(jié)構(gòu)與正常神經(jīng)基底膜結(jié)構(gòu)高度相似，利于引導(dǎo)再生軸突定向生長；微管內(nèi)徑較為均一，管徑在25μm～55μm之間（平均值為37.41±11.0μm），適于神經(jīng)軸突生長；平行微管間相互溝通的孔隙相連，溝通孔孔徑為20.68±4.61μm，利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸；相對(duì)封閉的外壁結(jié)構(gòu)，其壁厚為2.45±

8、1.43μm，此結(jié)構(gòu)在神經(jīng)再生過程中，將起到瘢痕屏障的作用，能夠在不影響營養(yǎng)物質(zhì)交通的情況下，有效的阻止瘢痕纖維的長入，保護(hù)再生纖維的順利通過。
　　經(jīng)過對(duì)比研究，確定了梯度冷凍干燥的制備最佳參數(shù)：膠原-殼聚糖混合比率為4：1，冰醋酸濃度為3mg/ml，梯度冷淋速度控制在2×10-5m/s的條件下，制備的支架材料具有最佳的三維仿生結(jié)構(gòu)和良好的性能，支架平均孔隙率達(dá)90％以上。其平均孔徑在30μm左右，能夠滿足理想支架對(duì)孔徑的要求：

9、小到能夠物理性制約并有效引導(dǎo)再生軸突的定向生長；大到能夠支持有效的血管化和再生支持細(xì)胞的滲入。
　　第二部分支架材料改性及生物相容性評(píng)測(cè)
　　目的：改善支架的機(jī)械性能和降解性，適應(yīng)體內(nèi)移植需要，并進(jìn)行相容性評(píng)價(jià)為體內(nèi)移植提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，奠定基礎(chǔ)。
　　方法：選用京尼平進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)改性，考量不同交聯(lián)條件下支架彈性模量、降解率等指標(biāo)，優(yōu)化交聯(lián)參數(shù)；根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)支架的細(xì)胞相容性和組織相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：本支架應(yīng)

10、用低生物毒性交聯(lián)劑——京尼平（1wt％）交聯(lián)48小時(shí)處理后，無論在干或濕的狀態(tài)下，其拉伸應(yīng)力均高于未交聯(lián)組，其彈性模量在濕的狀態(tài)下達(dá)3.938±1.326MPa，能夠維持三維空間結(jié)構(gòu)，對(duì)抗組織塌陷，機(jī)械性能基本滿足在體移植需求。交聯(lián)處理后，無論是在陰性對(duì)照液PBS中還是溶菌酶溶液中，支架在各時(shí)間點(diǎn)上的重量丟失比率均小于未交聯(lián)組，交聯(lián)支架8周PBS（無溶菌酶）溶液降解率為17.9±4.2％，溶菌酶溶液中降解率為20.1±4.6％，支架材料

11、在神經(jīng)再生過程中能夠保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，配合神經(jīng)軸突的再生。
　　經(jīng)京尼平交聯(lián)的支架材料對(duì)小鼠L929成纖維細(xì)胞無直接毒性作用，其浸提液對(duì)細(xì)胞各時(shí)限的毒性評(píng)定級(jí)別均為0～1級(jí)，對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長和增殖不構(gòu)成損害，肌肉植入法結(jié)果證實(shí)局部組織無不良反應(yīng)，有良好的細(xì)胞相容性和組織相容性。
　　第三部分支架材料修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損有效性評(píng)價(jià)
　　目的：評(píng)價(jià)高仿真支架修復(fù)神經(jīng)缺損的有效性。
　　方法：應(yīng)用免疫組織學(xué)、透射電鏡、神

12、經(jīng)電生理、逆行示蹤技術(shù)以及評(píng)測(cè)坐骨神經(jīng)指數(shù)等方法，從形態(tài)學(xué)和功能學(xué)兩方面綜合評(píng)價(jià)本支架橋接大鼠坐骨神經(jīng)15mm缺損的修復(fù)效果。
　　結(jié)果：形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示：移植術(shù)后4周膠原-殼聚糖支架仍能夠保持完整的軸向微管結(jié)構(gòu)，平行的微管之間有大量再生神經(jīng)纖維線性排列，沿軸向管壁定向生長；術(shù)后12周，支架材料幾乎完全降解吸收，被大量成束的再生神經(jīng)纖維所替代，證實(shí)了再生的神經(jīng)纖維長過了橋接段。透射電鏡結(jié)果：新生髓鞘比較纖細(xì)，結(jié)構(gòu)完整，有許多無髓

13、神經(jīng)纖維和大量由雪旺細(xì)胞包繞形成的有髓神經(jīng)纖維共存，并可觀察到完整的再生血管結(jié)構(gòu)和良好排列的髓鞘板層結(jié)構(gòu)，再生神經(jīng)軸突情況良好，修復(fù)效果接近自體神經(jīng)移植。
　　功能學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：支架材料組的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度、潛伏期和波幅與自體神經(jīng)移植結(jié)果接近，兩組之間差異無顯著性意義（p>0.05）；逆行示蹤標(biāo)記后，在脊髓前角和背根神經(jīng)節(jié)可檢測(cè)到與自體神經(jīng)移植組數(shù)量相當(dāng)?shù)臒晒饨饦?biāo)記陽性神經(jīng)元；坐骨神經(jīng)指數(shù)結(jié)果也同樣證實(shí)，膠原-殼聚糖支架橋接的坐