感覺神經(jīng)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束構(gòu)建神經(jīng)化組織工程骨修復(fù)兔股骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、組織工程學(xué)是應(yīng)用工程學(xué)原理和技術(shù)方法對(duì)創(chuàng)傷或病損的組織、器官進(jìn)行修復(fù)與重建，是一種全新的治療思路，超越了以往組織與器官修復(fù)重建的思維模式和技術(shù)手段，為組織與器官的修復(fù)重建帶來了一場(chǎng)理論和技術(shù)方法上的革命，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。創(chuàng)傷、感染、腫瘤等原因引起的骨缺損及骨不連是骨科臨床經(jīng)常遇到的問題，如何進(jìn)一步提高骨缺損的治療效果仍是引人關(guān)注的問題，臨床上常用自體骨或同種異體骨移植，由于存在骨來源有限或免疫排斥反應(yīng)等，使其應(yīng)用受到限制，臨床效

2、果不盡如意。利用組織工程學(xué)技術(shù)解決這一問題是近十多年骨科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。 如何提高大塊組織工程骨的成骨速度與成骨質(zhì)量是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。再血管化是最初和最基本的環(huán)節(jié)，有決定性的影響。如果不能建立有效血循環(huán)，組織工程材料的制作只能被限制在薄、小的程度。關(guān)于組織工程骨的再血管化技術(shù)方法仍處在探索之中。已經(jīng)證實(shí)，促進(jìn)血管再生、加快血管化過程可以提高組織工程骨的成骨速度與成骨質(zhì)量。 神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)于骨組織的生長(zhǎng)發(fā)育創(chuàng)傷修復(fù)具有調(diào)節(jié)和營(yíng)

3、養(yǎng)作用?，F(xiàn)在認(rèn)為，這種作用是肽能神經(jīng)通過包括神經(jīng)肽在內(nèi)的多種多肽類生物活性物質(zhì)的多種生物效能來實(shí)現(xiàn)的。神經(jīng)肽的作用方式很復(fù)雜，作用機(jī)理尚不完全清楚，可能是影響骨內(nèi)的血管發(fā)生，控制血管舒縮，調(diào)節(jié)骨內(nèi)血流量，進(jìn)而影響骨代謝，對(duì)骨組織的生長(zhǎng)發(fā)育和創(chuàng)傷修復(fù)過程發(fā)揮重要作用。 在組織工程骨內(nèi)同時(shí)植入血管神經(jīng)束的血管化、神經(jīng)化構(gòu)建方法，其意義是：通過即刻建立組織工程骨的血管供應(yīng)和神經(jīng)支配，使其進(jìn)入宿主的神經(jīng)、體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，納入與宿主一致的生

4、理反饋模式中，能對(duì)內(nèi)、外環(huán)境中各種變化因素(包括代謝環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、應(yīng)力刺激等)做出同機(jī)體整體功能相適應(yīng)的更積極的反應(yīng)，是從有活性的組織工程骨向有生命的骨的轉(zhuǎn)變。神經(jīng)化構(gòu)建理論必將影響和改變組織工程產(chǎn)品構(gòu)建的觀念，特別是對(duì)大塊組織工程植入物的設(shè)計(jì)思想和構(gòu)建方法具有指導(dǎo)性意義。 研究目的 1、建立一種可用于組織工程骨血管神經(jīng)化構(gòu)建實(shí)驗(yàn)研究的標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。要求：盡量減少實(shí)驗(yàn)干擾項(xiàng)；力學(xué)環(huán)境相似；貼近臨床工作的固定方法

5、；附近有可以進(jìn)行手術(shù)操作的動(dòng)靜脈血管束和感覺神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的解剖結(jié)構(gòu)；段缺性骨缺損量要大。 2、觀察感覺神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束對(duì)組織工程骨生長(zhǎng)改建的作用，探索一種為組織工程骨建立神經(jīng)支配的手術(shù)方法。 3、觀察組織工程骨內(nèi)植入血管束的血管化構(gòu)建方法對(duì)于組織工程骨內(nèi)植入神經(jīng)束的神經(jīng)化構(gòu)建方法在促進(jìn)組織工程骨的生長(zhǎng)改建方面的影響和作用。 實(shí)驗(yàn)方法 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨缺損模型的研究和制備 1、1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)解剖數(shù)據(jù)

6、的測(cè)量：選用五月齡成年新西蘭大白兔。實(shí)驗(yàn)部位為股骨。游標(biāo)卡尺測(cè)量股骨標(biāo)本的相關(guān)解剖數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 1、2骨缺損模型的手術(shù)方法：新西蘭大白兔18只，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別制作左股骨干中段10mm、15mm、20mm的骨及骨膜缺損，用4孔AO普通鋼板、螺絲釘及鋼絲固定。 1、3檢測(cè)方法：大體觀察，分別于4、8、12周各處死2只，取材，觀察缺損區(qū)骨痂生長(zhǎng)情況；攝X線片，觀察骨缺損手術(shù)結(jié)果及骨缺損區(qū)骨生長(zhǎng)愈合情況；

7、測(cè)量缺損區(qū)骨密度，了解骨缺損愈合程度；組織學(xué)檢查觀察缺損區(qū)形態(tài)和自行修復(fù)成骨情況。 2、感覺神經(jīng)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束構(gòu)建神經(jīng)化組織工程骨作用研究2、1組織工程骨的制備：髂前上嵴進(jìn)針穿刺抽取骨髓，經(jīng)離心后在37℃，飽和濕度，5％CO2條件下原代培養(yǎng)；細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)進(jìn)行傳代和成骨誘導(dǎo)。誘導(dǎo)條件：地塞米松1×10-7mol/L，維生素C50mg/L，β-甘油磷酸鈉10mmol/L。人工基質(zhì)材料為圓柱狀生物活性陶瓷β-磷酸三鈣(β-TCP)，長(zhǎng)

8、15mm，直徑7mm，在材料的側(cè)面預(yù)制2mm寬的側(cè)槽，直到材料中心。復(fù)合方法：經(jīng)過傳代培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞以3-5×106/ml的密度滴加接種到β-TCP上，孵育2天，成為組織工程骨。 2、2手術(shù)方法學(xué)研究：新西蘭大白兔，左側(cè)股骨，分為空白對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)組、感覺神經(jīng)組，各7只。 2、2、1空白對(duì)照組的手術(shù)方法：制備骨缺損模型，把預(yù)先構(gòu)建的組織工程骨植入骨缺損區(qū)。術(shù)畢籠養(yǎng)，抗生素預(yù)防感染。 2、2、2運(yùn)

9、動(dòng)神經(jīng)組的手術(shù)方法：選用股神經(jīng)的股直肌支。將解剖分離好的股神經(jīng)股直肌支通過組織工程骨的側(cè)槽植入組織工程骨中，7/O顯微縫合線固定防止神經(jīng)脫落。其它處理同空白對(duì)照組。 2、2、3感覺神經(jīng)組的手術(shù)方法：選用隱神經(jīng)。在大腿遠(yuǎn)1/3處截?cái)嗌窠?jīng)，近斷端在手術(shù)顯微鏡下做束間分離，做成長(zhǎng)短不一的爪形。將預(yù)制好的神經(jīng)植入組織工程骨的中央槽中，縫線固定。其它處理同空白對(duì)照組。 2、3檢測(cè)方法：每組任取1只4周時(shí)活體取材進(jìn)行免疫電鏡檢查，其

10、它6只完成12周的檢測(cè)：(1)大體觀察；(2)活體攝X光側(cè)位片檢查并對(duì)比；(3)活體測(cè)量骨密度，結(jié)果做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；(4)組織學(xué)檢查：觀察組織工程骨內(nèi)血管再生和骨生長(zhǎng)情況；(5)免疫電鏡檢查：一抗為抗神經(jīng)肽Y多克隆抗體，用免疫膠體金標(biāo)記，透射電鏡觀察。 3、血管束與感覺神經(jīng)束聯(lián)合構(gòu)建血管神經(jīng)化組織工程骨作用研究 3、1組織工程骨的制備同前。 3、2分組：空白對(duì)照組、血管束組、感覺神經(jīng)+血管束組，各7只。 3

11、、2、1空白對(duì)照組與本課題第二部分為同一組。 3、2、2血管束組的手術(shù)方法：選用股動(dòng)靜脈血管束。將股動(dòng)靜脈血管束充分解剖分離直到膝下，通過組織工程骨的側(cè)槽貫穿植入組織工程骨中。其它處理同空白對(duì)照組。 3、2、3感覺神經(jīng)+血管束組的手術(shù)方法：選用隱神經(jīng)和股動(dòng)靜脈血管束。在同一手術(shù)野中顯露股動(dòng)靜脈和隱神經(jīng)。隱神經(jīng)的處理同感覺神經(jīng)組；股動(dòng)靜脈血管束的處理同血管束組。其它處理同空白對(duì)照組。 3、3檢測(cè)方法：同本課題第二部

12、分。 結(jié)果 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨缺損模型的研究和制備 1、1通過分析相關(guān)解剖數(shù)據(jù)的測(cè)量結(jié)果，并經(jīng)模擬計(jì)算，證實(shí)了用四孔AO普通鋼板螺絲釘固定兔股骨的可行性。 1、2骨缺損模型手術(shù)結(jié)果分析：通過12周的大體觀察、X光檢查、骨密度定量分析及組織學(xué)檢查證明：10mm缺損組骨缺損區(qū)12周時(shí)被大量新生骨和軟骨組織填充；15mm、20mm骨缺損組在12周的觀察期內(nèi)一直由纖維結(jié)締組織填充，無橋接于兩骨端的骨組織生成。

13、 2、感覺神經(jīng)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束構(gòu)建神經(jīng)化組織工程骨作用研究 2、1組織工程骨的制備：經(jīng)過1-2周的原代培養(yǎng)和1-3周的成骨誘導(dǎo)、傳代培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與β-TCP復(fù)合成為組織工程骨，細(xì)胞材料相容性良好。 2、2手術(shù)方法學(xué)研究：通過12周的一般觀察、X線檢查、骨密度測(cè)量和組織學(xué)檢查證明：感覺神經(jīng)組成骨量顯著高于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)組和對(duì)照組；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)組成骨量與對(duì)照組比較無明顯差別。免疫電鏡檢查顯示：在四周的感覺神經(jīng)組標(biāo)本中見到了主要為交

14、感神經(jīng)特征的神經(jīng)肽Y免疫膠體金標(biāo)記物，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)組和未做神經(jīng)束植入的手術(shù)對(duì)照組無金顆粒標(biāo)記物顯示；以TBS代替神經(jīng)肽Y抗體的免疫標(biāo)記對(duì)照無金顆粒顯示。 3、血管束與感覺神經(jīng)束聯(lián)合構(gòu)建血管神經(jīng)化組織工程骨作用研究 3、1細(xì)胞培養(yǎng)及復(fù)合組織工程骨的結(jié)果同本課題第二部分。 3、2手術(shù)方法學(xué)研究 3、2、1一般觀察：術(shù)后4周活體探查血管束，見飽滿圓潤(rùn)，充盈良好，彈性好，無受壓現(xiàn)象，勒血試驗(yàn)證明血管雙向通暢。術(shù)后12

15、周，所有標(biāo)本骨性愈合。組織工程骨中植入血管束的部位形成類似滋養(yǎng)孔的結(jié)構(gòu)，且鋼板下組織工程骨表面血管豐富，位于材料中間，可見以一支血管為中心、多個(gè)分支血管放射狀分布的特征，形態(tài)上提示來源于骨內(nèi)；對(duì)照組鋼板下骨面血管稀疏，多位于組織工程骨兩端和邊緣，提示來源于周圍組織。 3、2、2通過12周的X線檢查、骨密度測(cè)量和組織學(xué)檢查證明：感覺神經(jīng)+血管束組成骨量顯著高于血管束組和對(duì)照組；血管組成骨量顯著高于對(duì)照組。免疫電鏡檢查：在四周的感覺

16、神經(jīng)+血管束聯(lián)合植入組標(biāo)本中見到神經(jīng)肽Y免疫膠體金標(biāo)記物，單純血管束植入組無金顆粒標(biāo)記物顯示；以TBS代替神經(jīng)肽Y抗體的免疫標(biāo)記對(duì)照無金顆粒顯示。 結(jié)論 1、鋼板螺絲釘固定的兔股骨干15mm的實(shí)驗(yàn)性骨缺損在12周的觀察期內(nèi)不能自行愈合，即兔股骨臨界缺損值為15mm，可以滿足構(gòu)建組織工程骨修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究需要。 2、兔股骨中段骨缺損模型可以滿足在組織工程骨內(nèi)分別移植或聯(lián)合移植感覺神經(jīng)(隱神經(jīng))、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)(股神經(jīng)

17、的股直肌支)、動(dòng)靜脈血管束(股動(dòng)靜脈)的實(shí)驗(yàn)需要。 3、在用組織工程骨修復(fù)兔股骨中段15mm骨與骨膜缺損的實(shí)驗(yàn)研究中，在組織工程骨中植入感覺神經(jīng)有促進(jìn)成骨作用，植入運(yùn)動(dòng)神經(jīng)沒有發(fā)現(xiàn)明顯的促進(jìn)成骨作用。 4、血管束植入法可以加快組織工程骨在體內(nèi)的生理性改建轉(zhuǎn)化過程，加快血管化過程，并促進(jìn)成骨，是一種快速的、具有很強(qiáng)臨床實(shí)用性的組織工程骨血管化構(gòu)建方法。 5、在用組織工程骨修復(fù)兔股骨中段15mm骨與骨膜缺損的實(shí)驗(yàn)研究