參附注射液對(duì)大鼠肢體缺血再灌注損傷的影響.pdf

1、缺血可引起組織器官的損傷，及時(shí)恢復(fù)缺血組織器官的血供是其功能和結(jié)構(gòu)得以保存的前提條件。但是，對(duì)于缺血時(shí)問(wèn)較長(zhǎng)的組織而言恢復(fù)血流往往產(chǎn)生更為嚴(yán)重的組織損傷，這一現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷。肢體缺血再灌注損傷是臨床常見(jiàn)的病理過(guò)程，多繼發(fā)于長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用止血帶后及肢體血管損傷、急性動(dòng)脈栓塞、斷肢再植等手術(shù)治療后，它不儀引起局部組織損傷甚至導(dǎo)致截肢，而且引發(fā)多器官損害，出現(xiàn)肝、腎、肺等功能衰竭，嚴(yán)重危及病人生命。如何減輕肢體缺血再灌注的損傷，降低肢體缺

2、血再灌注后的致殘率和死亡率逐漸成為研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為肢體缺血再灌注損傷的機(jī)制主要有：氧自由基的作用，一氧化氮(Nitric Oxide，NO)作用，鈣超載，各種細(xì)胞因子的參與以及白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞激活導(dǎo)致微循環(huán)障礙等。在此基礎(chǔ)上肢體缺血再灌注損傷的防治藥物研究也逐漸深入，大量研究已經(jīng)證明如維生素E、甘露醇、異丙酚、促紅細(xì)胞生成素等藥物對(duì)肢體缺血再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用。中藥對(duì)肢體缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究也愈來(lái)愈受到重視。參附注射液

3、(shenfu iniection)是根據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)“回陽(yáng)救逆”參附湯研制的一種治療厥脫證的藥物，通過(guò)分離滅菌水溶液制成，其有效成分為人參皂苷與烏頭類生物堿等，具有抗應(yīng)激、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體非特異性抵抗力、改善微循環(huán)的作用。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠肢體缺血再灌注模型，測(cè)定血液NO水平、腓腸肌組織中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性、丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)濃度以及鈣離子(Ca2+)負(fù)載；

4、腓腸肌組織提取總RNA，采用RT-PCR半定量分析Bc1-2-mRNA和Bax-mRNA轉(zhuǎn)錄水平；觀察腓腸肌組織形態(tài)學(xué)變化。通過(guò)觀察參附注射液對(duì)上述指標(biāo)的影響，來(lái)探討參附注射液對(duì)肢體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。 材料與方法:采用浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康SD大鼠40只，雌雄不拘，體重200-300g。術(shù)前常規(guī)禁食12小時(shí)，自由飲水。3％戊巴比妥鈉(事先用蒸餾水和戊巴比妥鈉粉劑配制)30mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。

5、橡皮止血帶環(huán)繞結(jié)扎雙后肢根部阻斷血流，使后肢急性缺血趾蒼白，溫度降低。4小時(shí)后松解結(jié)扎，恢復(fù)血流灌注4小時(shí)，后肢顏色恢復(fù)紅潤(rùn)，制成缺血再灌注模型。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組8只。正常組(A組)8只，僅麻醉及尾靜脈注射生理鹽水；肢體缺血4小時(shí)對(duì)照組(B0組)8只，缺血4小時(shí)后放開(kāi)橡皮止血帶，不進(jìn)行血液再灌注；肢體缺血再灌注4小時(shí)對(duì)照組(B4組)8只，缺血4小時(shí)后放開(kāi)橡皮止血帶，再灌注4小時(shí)；肢體缺血4小時(shí)給藥組(C0組)8只，應(yīng)

6、用參附注射液后缺血4小時(shí)，不進(jìn)行再灌注；肢體缺血再灌注4小時(shí)給藥組(C4組)8只，應(yīng)用參附注射液后缺血4小時(shí)，再灌注4小時(shí)。參附注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn))于肢體缺血前10min經(jīng)尾靜脈注射給藥(10ml/kg)，正常組(A組)和B0、B4組于相同時(shí)間給予同等體積的生理鹽水。 5組大鼠分別在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行解剖，下腔靜脈收集血液標(biāo)本測(cè)NO水平。取后肢腓腸肌組織測(cè)SOD活性、MDA濃度、Ca2-濃度、半定量分析Bcl-2-mR

7、NA和Bax-mRNA轉(zhuǎn)錄水平，HE染色光鏡觀察形態(tài)學(xué)變化，透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。 以SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以-x±s表示，組間樣本均數(shù)比較采用單兇素方差分析，P<0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果:1.Ca2+負(fù)載結(jié)果(單位：mg/kg組織濕重)：A組：7.18±1.86,B0組：156.99±20.47,B4組：211.33±53.48,C0組：30.38±5.86,C4組：157.6

8、4±19.47A組與B0組間P<0.01；B4組與B0組間P<0.05：C0組與B0組間P<0.01；C4組與B4組間P<0.05 2.SOD結(jié)果(單位：U/mg組織)：A組：1.88±0.16,B0組：1.59±0.05,R4組：1.06±0.08,C0組：1.76±0.10,C4組：1.61±0.05,A組與B0組間P<0.01；B4組與B0組間P<0.01；C0組與B0組間P<0.01；C4組與B4組間P<0.013.MOA結(jié)果(

9、單位：nmol/g組織)：A組：23.33±6.31,B0組：71.02±10.37,B4組：97.31±19.68,C0組：60.56±14.95,C4組：52.32±8.36,A組與B0組間P<0.01；B4組與B0組間P<0.01；C0組與B0組間P>0.05；C4組與B4組間P<0.014.NO結(jié)果(單位：μmol/1)：A組：21.04±5.47,B0組：48.70±10.25,B4組：108.84±14.51,C0組：26.

10、30±5.49,C4組：69.82±16.35,A組與B0組問(wèn)P<0.01；B4組與B0組間P<0.01；C0組與B0組問(wèn)P<0.01；C4組與B4組間P<0.015.RT-PCR結(jié)果：肢體缺血可導(dǎo)致骨骼肌Bcl-2基因表達(dá)、bcl-2/baX的比值降低，Bax基因表達(dá)增高(B0組與A組比，P<0.05)；再灌注后Bcl-2基因表達(dá)、bcl-2/bax的比值進(jìn)一步降低，Bax基因表達(dá)進(jìn)一步增高(B4組與B4組比，P<0.01)。應(yīng)用參附

11、注射液后，Bcl-2基因表達(dá)、bcl-2/baX的比值與對(duì)應(yīng)對(duì)照組比明顯增加，Bax基因表達(dá)與對(duì)照組比則明顯下降(C0組與B0組、C4組與B4組比，P<0.05)。 6.HE染色光鏡結(jié)果：正常的骨骼肌，肌纖維粗細(xì)均勻，排列整齊；缺血后肌纖維水腫，排列不整齊，部分溶解，并可見(jiàn)有少量白細(xì)胞與紅細(xì)胞滲出；再灌注后肌纖維出現(xiàn)水腫變性、斷裂甚至溶解，肌細(xì)胞嚴(yán)重破壞，斷裂肌纖維問(wèn)有大量白細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn)；給藥后缺血組和再灌注組骨骼肌水腫明顯

12、減輕，肌纖維變性較對(duì)照組為輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。 7.透射電鏡結(jié)果：大鼠正常腓腸肌，肌纖維排列整齊，肌細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰、核大、核仁明顯；線粒體結(jié)構(gòu)清晰。缺血后肌間隙增寬(水腫)，肌絲結(jié)構(gòu)紊亂，胞核縮小，染色質(zhì)邊集，核仁不清；線粒體腫脹，極性擴(kuò)張。再灌注組肌間隙增寬，胞核結(jié)構(gòu)不清，染色質(zhì)濃集，核仁消失，線粒體結(jié)構(gòu)不清。給藥后缺血組和再灌注組與相應(yīng)對(duì)照組比較肌纖維排列整齊，胞核結(jié)構(gòu)清，細(xì)胞凋亡程度明顯減輕；線粒體腫脹，結(jié)構(gòu)破壞程度均較對(duì)照組