攜帶人NIS基因和TPO基因的重組腺病毒聯(lián)合轉(zhuǎn)染肝癌細胞介導放射性碘攝取和有機化的基礎研究.pdf

1、目的：NIS基因轉(zhuǎn)染非甲狀腺腫瘤介導放射性核素內(nèi)放射治療成為腫瘤基因治療的又一研究方向。盡管轉(zhuǎn)染了NIS基因的腫瘤細胞或病灶，均能迅速大量攝取放射性碘，但碘在細胞或病灶內(nèi)停留時間短，療效不理想。我們利用腺病毒載體將NIS和TPO基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染肝癌細胞，試圖延長放射性碘在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的儲留時間，達到提高療效的目的。 方法：1.用RT-PCR方法從Graves'甲亢病人甲狀腺組織中擴增出hNIS和hTPO基因，亞克隆到質(zhì)粒載體，構(gòu)建成p

2、GEM-Teasy-NIS重組質(zhì)粒和PBK-CMV-TPO重組質(zhì)粒，通過酶切和DNA序列分析進行鑒定。 2.將hNIS和hTPO基因分別克隆到腺病毒AdEasier系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV上，通過在大腸桿菌BJ5183內(nèi)同骨架質(zhì)粒pAdEasy-1同源重組、并在293細胞中包裝、擴增，純化、構(gòu)建攜帶hNIS和hTPO的重組腺病毒AdNIS和AdTPO,測定病毒滴度。Western-Blotting檢測重組腺病毒AdN

3、IS和AdTPO的表達。 3.AdNIS單獨轉(zhuǎn)染，AdNIS和AdTPO聯(lián)合轉(zhuǎn)染肝癌細胞HepG2，確定最適MOI，動態(tài)檢測125I的攝取、觀測NaClO4對碘攝取抑制情況、TCA蛋白沉淀檢測碘化蛋白、動態(tài)檢測碘排泄情況，細胞克隆形成實驗評價單獨和聯(lián)合轉(zhuǎn)染131I細胞毒性作用。 4.荷瘤裸鼠瘤體內(nèi)引入AdNIS，免疫組化檢測腫瘤NIS表達，測定注射125I后各時間點組織器官放射性，計算每克組織百分注射劑量率(％ID/g)

4、，進行131I荷瘤裸鼠腫瘤顯像研究。 結(jié)果：1.酶切、DNA序列分析鑒定hNIS和hTPO基因克隆成功。 2.構(gòu)建重組腺病毒AdNIS和AdTPO，測定滴度分別為1.5×109efu/ml、2.0×109efu/ml。AdNIS和AdTPO轉(zhuǎn)染人肝細胞癌HepG2細胞，經(jīng)SDS-PAGE電泳，分別探測到90kD和110kD的特異性的蛋白，免疫雜交能與小鼠抗人NIS或TPO單克隆抗體結(jié)合。 3.轉(zhuǎn)染AdNIS的He

5、pG2細胞能迅速攝取125I，其攝取能力為未轉(zhuǎn)染組的24倍，攝碘功能可被NaClO4特異性抑制，16min時一半的125I已流出細胞外。聯(lián)合轉(zhuǎn)染AdNIS和AdTPO不能提高細胞對碘的攝取(p＞0.05)，但可部分有機化碘，125I流出細胞延緩，Tl/2efflux約為25min。AdNIS單獨轉(zhuǎn)染可使40％細胞、聯(lián)合轉(zhuǎn)染可使60％細胞被131I選擇性殺死。 4.免疫染色檢測到NIS在腫瘤組織中的表達，且定位于細胞膜；2h時腫瘤

6、組織攝取125I最高，為10.10±1.81％ID/g，125I在腫瘤組織內(nèi)的生物半衰期為2.35h。轉(zhuǎn)染NIS的肝癌荷瘤裸鼠注射131I后2h，腫瘤部位放射性濃聚，腫瘤顯示清晰。 結(jié)論：成功克隆hNIS和hTPO基因，利用腺病毒AdEasier系統(tǒng)，快速、簡便獲取高滴度的重組腺病毒AdNIS和AdTPO。AdNIS轉(zhuǎn)染可使肝癌細胞獲得攝碘功能，聯(lián)合轉(zhuǎn)染AdNIS和AdTPO，可部分有機化碘，但只能輕度延長125I在細胞內(nèi)的停留