二甲雙弧對AMPK、PPARγ的影響與胰島素抵抗的研究.pdf

1、目的:1、通過觀察2型糖尿病模型大鼠脂肪組織中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的表達(dá)，及二甲雙胍對其影響，探討二甲雙胍改善糖、脂代謝、胰島素敏感性機(jī)制，為二甲雙胍的臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。2、通過體外建立3T3-L1細(xì)胞胰島素抵抗模型，應(yīng)用二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)治療，觀察胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下AMPK、PPARγ、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(GLUT4)的表達(dá)情況，并觀察二甲雙胍對AMPK、PPARγ的作用，分析其

2、對胰島素抵抗的干預(yù)作用是否與上調(diào)AMPK、PPARγ有關(guān)。
　　 方法:1、正常wistar雄性大鼠30只普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組(NC組)和糖尿病組（DM組）。NC組給予普通飼料至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。DM組給予高脂飲食聯(lián)合腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)40mg/kg的方法制備2型糖尿病模型，造模成功后隨機(jī)分為模型組(DM-C)和治療組(DM-T)。DM-T組給予鹽酸二甲雙胍(Metfor

3、min，met)灌胃治療4周。測定大鼠治療前后的體重，實(shí)驗(yàn)?zāi)y定各組大鼠腎周及睪周脂肪重量，計(jì)算大鼠脂體比;檢測各組大鼠空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、胰島素(insulin，INS)、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(total cholesterol，TG)、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL-C）、低密度脂蛋白的水平(Low d

4、ensitylipoprotein，LDL-C)，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(Fasting sensitive index，ISI);實(shí)時(shí)熒光定量(real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測各組大鼠脂肪組織AMPK及PPARγmRNA的水平。2、以美國國立細(xì)胞庫(American Type CultureCollection，ATCC)3T3-L1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化。參考Ani

5、lKumar KL分化前脂肪細(xì)胞的方法，對細(xì)胞進(jìn)行分化:將3T3-L1前脂肪細(xì)胞置于含15％小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃，5％C02飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)接種于培養(yǎng)皿，加入含0.5 mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、10ug/mL胰島素、1umol/I地塞米松15％小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，之后換以含1ug/mL胰島素的培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h，隨后以15％小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)

6、培養(yǎng)，2d換培養(yǎng)液1次，誘導(dǎo)分化8～12 d的3T3-L1細(xì)胞，80％～90％以上呈脂肪細(xì)胞表型可用于試驗(yàn)。運(yùn)用油紅O染色證明前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成為成熟脂肪細(xì)胞:移去誘導(dǎo)分化結(jié)束細(xì)胞的培養(yǎng)基，用PBS清洗，用10％多聚甲醛固定30min，加入油紅O溶液染色30min，用異丙醇脫色，然后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，倒置顯微下觀察、照相。3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立及藥物處理。對分化好的細(xì)胞分組進(jìn)行處理:加1umol/L地塞米松誘導(dǎo)胰島

7、素抵抗，每2d換1次液，取上清液，以培養(yǎng)基中的葡萄糖的消耗量差值反映胰島素抵抗的程度。葡萄糖含量用葡萄糖檢測試劑盒測定。在胰島素抵抗模型成立以后，設(shè)空白對照組、地塞米松模型組、藥物干預(yù)組（不同濃度二甲雙胍）在藥物處理48 h后檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量，及AMPK、PPARγ、GLUT4mRNA水平。
　　 結(jié)果:高脂飲食配合小劑量鏈脲佐菌素制備糖尿病大鼠模型中，1、體重。二甲雙胍治療前DM大鼠體重比NC組大鼠體重顯著升高(P＜0.

8、05);二甲雙胍治療4周后，DM-T組大鼠與DM-C組之間比較，DM-T組大鼠體重下降明顯減輕(P＜0.05)。2、腎周、睪周脂肪組織重量及脂體比。與NC組比較，DM-C組腎周睪周脂肪組織重量和脂體比均顯著下降(P＜0.05);與DM-C組比較，DM-T組腎周睪周脂肪組織重量顯著增高(P＜0.05)，脂體比無顯著性差異(P＞0.05)。3、血糖、胰島素水平及胰島素敏感指數(shù)。與NC組比較，DM-C組和DM-T組大鼠血清FPG水平顯著升高(

9、P＜0.05)，F(xiàn)INS、ISI顯著下降(P＜0.05);與DM-C組比較，DM-T組血清FPG顯著下降(P＜0.05)，F(xiàn)INS，ISI水平顯著升高(P＜0.05)。4、血脂。與NC比較，DM-C組大鼠血清TC、TG、LDL水平顯著升高(P＜0.05)，HDL水平顯著下降(P＜0.05);與DM-C組比較，DM-T組血清TC、TG、LDL水平顯著下降(P＜0.05)，HDL水平顯著升高(P＜0.05)。5、脂肪組織AMPK和PPARγ

10、 mRNA的水平。與NC組比較，DM-C、DM-T組AMPK與PPARγmRNA表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05);與DM-C組比較，DM-T組AMPK與PPARγmRNA表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)。
　　 在3T3-L1脂肪細(xì)胞中1、3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)、分化10天，油紅O染色，鏡下可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂肪滴被染成紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，證實(shí)為成熟脂肪細(xì)胞。2、在地塞米松模型組細(xì)胞上清培養(yǎng)液的葡萄糖吸光度OD值顯著高于空白

11、組(P＜0.05)，地塞米松作用后96h細(xì)胞上清培養(yǎng)液的葡萄糖差值最大(P＜0.05)，胰島素抵抗達(dá)最佳狀態(tài)。3、二甲雙胍干預(yù)組培養(yǎng)液的葡萄糖吸光度OD值較模型組低(P＜0.05)。4、地塞米松模型組的AMPK、PPARγ、GLUT4mRNA水平顯著低于空白組(P＜0.05)。5、二甲雙胍干預(yù)組AMPK、PPARγ、GLUT4mRNA水平明顯著高于模型組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:高脂飲食配合小劑量鏈脲佐菌素制備糖尿病大鼠模

12、型中，1、糖尿病大鼠脂肪組織AMPK及PPARγ mRNA的水平下降。2、二甲雙胍上調(diào)2型糖尿病大鼠脂肪組織AMPK及PPARγ mRNA的水平。3、二甲雙胍改善糖尿病大鼠的糖、脂代謝及胰島素抵抗。4、二甲雙胍可能通過上調(diào)2型糖尿病大鼠脂肪組織AMPK及PPARγ mRNA，調(diào)節(jié)機(jī)體糖、脂代謝，增加胰島素敏感性。在3T3-LI脂肪細(xì)胞中，1、地塞米松誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率下降。2、二甲雙胍干預(yù)后3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素