β-arrestin1與EZH2結(jié)合調(diào)控慢性粒細(xì)胞白血病增殖.pdf

1、目的：
　　在我們的前期研究中，發(fā)現(xiàn)β-arrestin1通過影響基因組的表觀遺傳學(xué)改變，來促進(jìn)體內(nèi)外CML細(xì)胞的增殖。本研究的主要目的旨在尋找β-arrestin1是怎樣通過影響基因的表觀遺傳學(xué)修飾進(jìn)而調(diào)控CML增殖，為尋找針對(duì)CML的分子機(jī)制，及可能的潛在治療分子靶點(diǎn)提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.利用前期研究中采用的對(duì)照質(zhì)粒Fugw（Ctrl）及抑制β-arrestin1(siβ1)慢病毒體系感染CMLK

2、562細(xì)胞，利用有限稀釋法進(jìn)行穩(wěn)定篩選K562-Ctrl和K562-siβ1細(xì)胞。
　　2.采用Westrenblot，免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP）及免疫熒光激光共聚焦技術(shù)分別檢測(cè)K562-Ctrl和K562-siβ1細(xì)胞中EZH2蛋白的表達(dá)，比較β-arrestin1與EZH2的結(jié)合與在細(xì)胞中定位的差異。
　　3.利用EZH2抑制劑3-deazaneplanocinA(DZNep)2μm處理K562-Ctrl細(xì)胞48h，分

3、別采用Co-IP技術(shù)檢測(cè)對(duì)β-arrestin1與EZH2結(jié)合的影響；利用甲基化特異PCR（MSP）和染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）技術(shù)來檢測(cè)P15、P16、和PTEN等抑癌基因的表觀遺傳學(xué)變化；利用RT-PCR檢測(cè)抑癌基因的表達(dá)變化。
　　4.利用EZH2抑制劑DZNep處理K562-Ctrl細(xì)胞和CML模型鼠通過克隆形成實(shí)驗(yàn)，老鼠生存曲線的觀察來分析對(duì)體內(nèi)外CML增殖的影響
　　結(jié)果：
　　1.穩(wěn)定篩選的CMLK56

4、2-Ctrl和K562-siβ1細(xì)胞中，EZH2蛋白表達(dá)無差異，即抑制K562細(xì)胞中β-arrestin1表達(dá)，不影響EZH2蛋白的表達(dá)。
　　2.Co-IP和免疫熒光共聚焦顯微鏡技術(shù)均顯示在K562-Ctrl和K562-siβ1細(xì)胞中β-arrestin1與EZH2結(jié)合與共定位在細(xì)胞核內(nèi)。在K562-siβ1細(xì)胞中，β-arrestin1-EZH2結(jié)合明顯弱于在K562-Ctrl細(xì)胞中。
　　3.2μmEZH2抑制劑DZN

5、ep處理K562-Ctrl細(xì)胞48h后，Co-IP結(jié)果顯示DZNep能明顯抑制EZH2-β-arrestin1結(jié)合；RT-PCR結(jié)果顯示DZNep能明顯上調(diào)抑癌基因P15、P16和PTEN表達(dá)；MSP結(jié)果顯示DZNep能明顯抑制P15、P16和PTEN甲基化水平；ChIP結(jié)果顯示DZNep能明顯上調(diào)P15、P16和PTEN基因乙?；健?br>　　4.EZH2抑制劑DZNep處理K562-Ctrl細(xì)胞48h后，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DZ

6、Nep能明顯抑制細(xì)胞增殖；2mg/kgEZH2抑制劑DZNep連續(xù)每天處理CMLNOD/SCID模型鼠20d，發(fā)現(xiàn)DZNep能明顯延長CML白血病老鼠壽命。
　　結(jié)論：
　　慢性粒細(xì)胞白血病中，β-arrestin1可與EZH2結(jié)合，調(diào)控體內(nèi)外CML細(xì)胞的增殖，β-arrestin1-EZH2結(jié)合可影響抑癌基因P15、P16和PTEN基因的表觀遺傳學(xué)改變與表達(dá)。該研究為闡釋?duì)?arrestin1調(diào)控CML增殖的表觀遺傳學(xué)機(jī)制