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文檔簡介
1、闡明精子功能調控機制是診斷和治療男性不育、研發(fā)新型男性避孕藥的前提。離子通道是調控精子功能的關鍵因子。精子特異性SLO3通道是生理條件下調控精子功能的主要K+通道。離體實驗表明,睪丸特異性表達的LRRC52(Leucine-Rich-Repeat-Containingprotein52)具有調節(jié)SLO3通道的功能。然而,LRRC52是否為SLO3的在體調節(jié)亞基尚不清楚。本研究設計、制備抗LRRC52胞外段的多克隆抗體,對小鼠和正常人精子
2、LRRC52生理功能及其機制進行研究。應用分子生物學、免疫熒光、電生理及精子功能分析等手段,我們發(fā)現LRRC52是SLO3通道的在體調節(jié)亞基,是介導精子鉀電流(IKSper)的關鍵組分。此外,我們的結果還提示,LRRC52可作為設計精子功能調控化合物的分子靶點。
第一部分:LRRC52在小鼠成熟精子的表達、定位及與SLO3的關系
為獲得能從細胞外特異性作用于LRRC52的化合物,我們設計制備了抗LRRC52胞外段的多
3、克隆抗體(LID1)。通過Westernblot、精子凝集實驗、免疫熒光和免疫共沉淀等技術,我們驗證了所獲抗體的特異性,研究了在體條件下LRRC52與SLO3的相關性。結果表明:1)小鼠精子蛋白中可檢測到LRRC52,LID1孵育的精子發(fā)生明顯的凝集反應;2)LRRC52分布于小鼠精子尾部,尤以中段明顯,并與SLO3存在明顯的共定位;3)小鼠精子LRRC52與SLO3構成蛋白復合體。這些結果提示,LRRC52是SLO3的潛在調節(jié)亞基。<
4、br> 第二部分:LRRC52對小鼠成熟精子膜電流的影響
為闡明LRRC52的生理功能,我們應用全細胞膜片鉗技術研究了LID1對精子膜電流的影響。結果表明:1)LID1顯著抑制小鼠IKSper但不影響精子鈣電流(ICatSper);2)LID1對IKSper電導-電壓曲線(G-V曲線)的影響與異體表達系統中LRRC52亞基對SLO3的作用相符。這些結果提示LRRC52是構成精子鉀通道、介導精子鉀電流的重要組分。
第
5、三部分:LRRC52對小鼠成熟精子生理功能的影響
應用計算機輔助精子分析(CASA)、金霉素(CTC)染色、體外受精(IVF)、調節(jié)性體積下降(RVD)檢測等實驗手段,我們觀察了LID1對精子活力、頂體反應(AR)、體外受精能力及RVD等相關生理功能指標的影響。結果表明:1)LID1顯著抑制小鼠精子總運動力、直線速度(VSL)、曲線速度(VCL)和平均路徑速度(VAP);2)LID1不影響自發(fā)性AR的發(fā)生率,但顯著抑制A231
6、87誘發(fā)的AR發(fā)生率;3)LID1孵育對精子RVD能力的影響不顯著;4)LID1顯著抑制小鼠精子的體外受精率。這些結果提示,LRRC52在精子生理功能中扮演重要角色,是開發(fā)調控精子功能化合物的潛在分子靶點。
第四部分:LRRC52在人成熟精子的表達及其生理功能
介導人精子IKSper的離子通道分子組成尚不清楚。由于用于制備LID1的LRRC52抗原片段在小鼠與人完全相同,我們用LID1初步觀察LRRC52在人精子的表
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