類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞類腫瘤樣增生及加味木防己湯的調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種以多發(fā)性關(guān)節(jié)組織炎性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病。病理特征為滑膜細(xì)胞增生、血管翳形成、單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而軟骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞。該病變呈持續(xù)性，反復(fù)發(fā)作過程，對(duì)人體損害大，致殘率高。 目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但RA的病情進(jìn)展體現(xiàn)了炎癥、自身免疫和滑膜增生這三種病理生理過程。RA的發(fā)病過程中，免疫網(wǎng)絡(luò)失衡，加上成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-1ikes

2、ynoviocytes，F(xiàn)LS)的類腫瘤樣生長(zhǎng)及所分泌的大量促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶，是導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)炎性細(xì)胞聚集，滑膜細(xì)胞增生和向周圍組織侵蝕及基質(zhì)降解和破壞的主要因素?；ぱ资亲罹咛卣餍缘牟±砀淖儯そM織表現(xiàn)為增生性侵蝕性生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)性質(zhì)及病理學(xué)行為在許多方面類似于腫瘤組織的特性，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨組織造成進(jìn)行性破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。因此，調(diào)控FLS的增生和活化，將有利于控制RA的發(fā)生和發(fā)展。 加味木防己湯是在傳統(tǒng)

3、經(jīng)方基礎(chǔ)上研制而成，具有祛風(fēng)除濕、清熱通絡(luò)和溫陽補(bǔ)虛之功效；其中醫(yī)治則為清除外邪、益氣養(yǎng)血，急則治標(biāo)、扶正固本。我們?cè)陉U述RA滑膜細(xì)胞增生病變機(jī)制的同時(shí)，選用加味木防己湯作為調(diào)控RS滑膜細(xì)胞過度增生的有效方藥，不僅有利于發(fā)掘和提高傳統(tǒng)中藥的配伍形式，而且有利于提高臨床療效。 大鼠AIA動(dòng)物模型在臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和病理免疫機(jī)制上，與人類RA有著相似或相近的特點(diǎn)，是研究RA篩選抗炎免疫藥物的較理想模型。本實(shí)驗(yàn)研究在此模型的基礎(chǔ)上

4、，探討大鼠滑膜細(xì)胞類腫瘤樣增生相關(guān)機(jī)制及中藥木防己湯的調(diào)控機(jī)制。 1.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CFA誘發(fā)大鼠AIA模型，于致敏后2，5，10、17、28、39d，測(cè)量致炎側(cè)踝關(guān)節(jié)的腫脹度。結(jié)果表明AIA模型組大鼠足跖的腫脹度均明顯高于正常對(duì)照組。致炎39d，病理片顯示AIA組大鼠關(guān)節(jié)囊內(nèi)滑膜增生，有新生血管翳形成，同時(shí)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，軟組織明顯水腫，關(guān)節(jié)間隙增寬，骨及軟骨被破壞。同時(shí)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯低于正常組。木防己湯能夠減輕AI

5、A大鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹度，增加胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，減輕關(guān)節(jié)滑膜增生和炎性病變，對(duì)RA具有明顯的治療作用。 2.以AIA大鼠作為動(dòng)物模型，經(jīng)加味木防己湯治療21天之后，檢測(cè)各組大鼠血清IL-1和TNF-α水平的差異，同時(shí)檢測(cè)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子IL-4，IL-10水平的差異。結(jié)果AIA大鼠血清IL-1、TNF-α、IFN-γ的表達(dá)均明顯高正常組，血清IL-4，IL-10的含量明顯低于正常組大鼠，表明AIA大鼠血

6、清中TH1/TH2細(xì)胞因子的平衡遭到破壞。木防己湯治療組大鼠，血清中致炎性細(xì)胞因子TNF-α與IL-1的含量明顯低于AIA模型組，與雷公藤組接近。血清中IFN-γ的生成量明顯低于AIA模型組，而對(duì)于炎癥抑制性細(xì)胞因子IL-4，IL-10的含量明顯高于AIA模型組，與雷公藤組接近。提示木防己湯治療AIA的機(jī)理可能與下調(diào)血清中異常升高的IL-1和TNF-α水平有關(guān)。加味木防己湯可能具有調(diào)節(jié)AIA大鼠血清中TH1/TH2細(xì)胞因子的平衡的趨勢(shì)。

7、 3.應(yīng)用大鼠滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)觀察AIA大鼠滑膜細(xì)胞的類腫瘤樣增生效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常大鼠的關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞體外增殖率很低，而AIA組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)增殖明顯提高，即使無TNF-α刺激時(shí)，其增殖已明顯高于正常大鼠；而在TNF-α刺激下，其增殖雖依然高于正常大鼠，但與自身無TNF-α刺激的條件相比較，差異無顯著性。推測(cè)AIA組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過程中受到自身各種細(xì)胞因子(自分泌和旁分泌)的作用經(jīng)活化增殖，出現(xiàn)

8、了類似腫瘤樣的改變。加味木防己湯治療組大鼠滑膜細(xì)胞的過度增生受到了明顯抑制。 4.采用半定量RT-PCR法，檢測(cè)了AIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中c-myc和ODCmRNA的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中有較低水平c-myc和ODCmRNA的表達(dá)，但在AIA組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中c-myc和ODCmRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯增高，提示AIA組大鼠滑膜組織中這兩種基因在轉(zhuǎn)錄水平被異常激活，因而可表達(dá)過量的mRNA，刺激多胺生成，

9、是滑膜細(xì)胞過渡增殖，凋亡不足，腫瘤樣變的原因之一。加味木防己湯治療后，AIA大鼠滑膜細(xì)胞的過度增生受到了明顯抑制，且滑膜組織中，c-myc和ODC基因的mRNA表達(dá)水平均顯著下降。提示加味木防己湯可能通過抑制c-myc活化，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)ODC基因的mRNA表達(dá)，減少多胺生成等多個(gè)環(huán)節(jié)，抑制AIA滑膜的過度增生。 5.通過對(duì)體外培養(yǎng)的原代大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞培養(yǎng)液酶譜分析顯示，正常大鼠滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的膠原酶以MMP-2為主，而AI

10、A大鼠則同時(shí)表達(dá)MMP-2和MMP-9；加味木防己湯治療組大鼠滑膜產(chǎn)生的MMP-2和MMP-9均較AIA大鼠明顯下降，并且能抵制TNF-α對(duì)MMP-9生成的影響。提示加味木防己湯不僅能直接抑制MMPs的分泌，還能抵抗TNF-α的刺激作用，具有改變病程調(diào)控發(fā)病功效。 綜上所述，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞類腫瘤樣增生，與血清細(xì)胞因子異常，平衡關(guān)系紊亂；基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9生成增加；c-myc和ODC基因異常激活，mRN