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文檔簡介
1、第一部分:編碼人GIRK4基因的shRNA序列篩選及腺病毒表達載體的構(gòu)建
實驗一:人GIRK4的shRNA真核表達載體質(zhì)粒構(gòu)建
目的:構(gòu)建編碼人GIRK4的shRNA真核表達載體質(zhì)粒,為利用基因沉默技術從轉(zhuǎn)錄后水平進行GIRK4的研究做準備。
方法:根據(jù)人GIRK4序列設計并合成四組shRNA寡核苷酸片段,退火形成雙鏈并克隆進入載體pGCsi-U6,并進行PCR鑒定和測序。
結(jié)果:PCR證明構(gòu)建的
2、shRNA已插入載體,經(jīng)測序證明與與設計的相同,獲得人GIRK4的shRNA表達載體質(zhì)粒(pGCsi-GIRK4-shRNA-U6)。
結(jié)論:構(gòu)建的GIRK4的shRNA真核表達載體可進入哺乳動物細胞內(nèi)表達短發(fā)夾RNA,經(jīng)Dicer酶裂解成siRNA并降解靶基因mRNA,而達到基因干擾的作用,為利用其進行GIRK4功能研究奠定了基礎。
實驗二:人GIRK4的真核表達載體質(zhì)粒構(gòu)建
目的:構(gòu)建編碼人GIRK4真
3、核表達載體質(zhì)粒,為進行人GIRK4的shRNA序列的篩選作準備。
方法:以購買的人GIRK4基因為模板,PCR其cDNA編碼序列并克隆進入載體pEGFP-C1,并進行PCR鑒定、測序及轉(zhuǎn)染293細胞在熒光顯微鏡下觀察。
結(jié)果:PCR證明cDNA已插入載體,經(jīng)測序證明與與設計的相同,獲得人GIRK4融合蛋白的表達載體質(zhì)粒(pEGFP-GIRK4-C1),并能轉(zhuǎn)染293細胞表達融合蛋白。
結(jié)論:構(gòu)建的人GIRK
4、4真核表達載體可進入哺乳細胞內(nèi)表達GIRK4-EGFP融合蛋白,為進行針對GIRK4基因RNA干涉序列篩選打下基礎。
實驗三:人GIRK4基因RNA干涉序列的篩選
目的:RNA干擾是基因技術的重要進展,人們可以在轉(zhuǎn)錄后水平減少基因的表達。對RNAi是否有效而言,基因靶序列的選擇是至關重要的因素。我們研究了外源表達系統(tǒng)中(HEK293cell)GIRK4-shRNA沉默GIRK4基因表達的有效性及選擇高效的干涉序列。<
5、br> 方法:將已構(gòu)建的四個靶向GIRK4基因的不同區(qū)域GIRK4的shRNA表達載體質(zhì)粒(pGCsi-GIRK4-shRNA-U6)、對照質(zhì)粒分別與與人GIRK4的真核表達載體質(zhì)粒(pEGFP-GIRK4-C1)共轉(zhuǎn)染HEK293細胞,收集轉(zhuǎn)染后48h的細胞,進行Westernblotting檢測。
結(jié)果:轉(zhuǎn)染48小時之后,與對照組相比,四個不同序列的shRNA表達載體質(zhì)粒(pGCsi-GIRK4-shRNA-U6)使GI
6、RK4蛋白表達在48小時分別減少78.1%、85.3%、88.3%、94.3%,其中以4#載體序列是最有效的干涉序列,其序列為:GGCTGAGCAGAATGAAGAA。
結(jié)論:成功地在外源表達系統(tǒng)篩選出高效的針對人GIRK4基因的高效RNA干涉序列。
實驗四:重組腺病毒載體Ad-GIRK4-shRNA的構(gòu)建及鑒定
目的:利用AdMax腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-GIRK4-shRNA并在293細胞
7、中擴增制備重組腺病毒載體。
方法:人工合成針對GIRK4的4#高效干涉序列,將其克隆到pDC316-EGFP-U6載體中,將pDC316-GIRK4-shRNA-EGFP-U6載體和骨架病毒pBHGlox_E1,3Cre共轉(zhuǎn)染293細胞,包裝成重組的病毒顆粒,并進行PCR鑒定和測序。
結(jié)果:經(jīng)PCR鑒定和測序,證實成功地構(gòu)建了攜帶人GIRK4的4#高效干涉序列重組腺病毒載體(Ad-GIRK4-shRNA)并制備出高滴
8、度重組病毒。
結(jié)論:成功地構(gòu)建了攜帶人GIRK4shRNA片段的重組腺病毒載體(Ad-GIRK4-shRNA),為進一步進行GIRK4的研究奠定了基礎。
第二部分:人心房肌細胞培養(yǎng)
目的:培養(yǎng)出一定數(shù)量和具有良好狀態(tài)的人心房肌細胞。
方法:聯(lián)合運用Ⅰ型膠原酶和ⅩⅣ型蛋白酶消化人右心耳的標本,并利用差
速貼壁法消除大部分非心肌細胞,并利用actin抗體進行免疫組化鑒定。
結(jié)果:成
9、功培養(yǎng)出一定數(shù)量人心房肌細胞,經(jīng)actin抗體鑒定90%以上均為心肌細胞。
結(jié)論:成功培養(yǎng)出人心房肌細胞,為今后進行下一步實驗打下了基礎。
第三部分:腺病毒介導的Ad-GIRK4-shRNA對人心房肌細胞GIRK4干涉的實驗研究
目的和背景:心房顫動是臨床上最常見的心律失常之一,其與迷走神經(jīng)系統(tǒng)密切相關;心臟迷走神經(jīng)通過釋放的乙酰膽堿,作用于心房M2受體-G蛋白-IKACh通路,激活IKACh。GIRK4是
10、IKACh的功能亞單位,基因敲除的GIRK4小鼠不能誘發(fā)房顫。本實驗通過將腺病毒介導的GIRK4shRNA導入人心房肌細胞,觀察在人心房肌細胞進行RNA干涉GIRK4的問題、可行性及對迷走神經(jīng)通路上的GIRK1、M2AChR表達及IKACh電流密度的影響,為今后將RNA干涉技術引入心律失常機制的研究及基因治療提供新思路和初步經(jīng)驗。方法:將重組腺病毒載體Ad-GIRK4-shRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人心房肌細胞,收集轉(zhuǎn)染后不同時間的細胞,利用RT
11、-PCR、蛋白印跡來檢測GIRK4、GIRK1、M2AChR的表達及用全細胞膜片鉗技術來檢測IKACh、IK1電流密度的變化。結(jié)果:Ad-GIRK4-shRNA在MOI20對人心房肌細胞轉(zhuǎn)染效率即達到95%以上;在mRNA水平和蛋白水平降低了GIRK4的表達,呈現(xiàn)出劑量依賴性和時間依賴性:MOI為5,20,50時,Ad-GIRK4-shRNA干涉效率分別為15.1%,35.2%,51.1%(P<0.05);與空病毒感染組相比較,Ad-G
12、IRK4-shRNA感染人心房肌細胞后GIRK4mRNA表達水平分別為在24h、48h、96h分別為50.9%、14.7%、98.1%。Ads-GIRK4-shRNA在mRNA水平和蛋白水平分別使GIRK1表達降低了27.9%,20.2%(P<0.05);使M2AChR的表達增加了19.6%,18.6%(P<0.05)。Ad-GIRK4-shRNA對IK1的電流密度無影響(P>0.05),使IKACh的電流密度下降了53%(P<0.05
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