普城沙雷氏菌G3菌株GGDEF-EAL結(jié)構(gòu)域蛋白PigX的功能研究.pdf

1、化學農(nóng)藥和化肥的過度使用已經(jīng)對環(huán)境和食品安全構(gòu)成嚴重威脅。開發(fā)利用環(huán)境友好的有益微生物進行植物病害生物防治作為化學防治的替代或補充，有利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、維護生態(tài)平衡和保障食品安全性。但是生防微生物也存在抗菌譜狹窄、生防活性不穩(wěn)定等缺點。因此篩選新的靶標基因構(gòu)建具有高效和穩(wěn)定生防活性的工程菌株具有重要的理論價值和應用前景。GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白在細菌中廣泛存在，大量研究已表明它們參與調(diào)控細菌運動性、生物膜形成、致病性、細胞分化和增

2、殖等多種生命活動。然而，在植病生防菌中GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的相關(guān)研究至今尚未見報道。
　　普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）G3是分離自小麥內(nèi)莖的內(nèi)生菌，能夠產(chǎn)生多種抗真菌因子如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin, PRN)，以及植物促生物質(zhì)吲哚乙酸 IAA與乙偶姻，因而具有一定的生防和促生潛能。前期研究已表明 QS系統(tǒng)、Rsm系統(tǒng)、Hfq和 RpoS等全局調(diào)控因子參與調(diào)控 G3菌株

3、的生防活性。通過分析 S. plymuthica G3基因組序列鑒定了一個編碼GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的基因pigX，但是功能未知。
　　本研究以 S. plymuthica G3為模式菌鑒定pigX基因的生物學功能。首先通過構(gòu)建突變體和表型分析等策略，初步鑒定了PigX調(diào)控的生防相關(guān)表型；然后利用lux和lacZ報告基因分別構(gòu)建轉(zhuǎn)錄和翻譯融合，分析了PigX調(diào)控運動性和PRN合成等的分子機制，以及與QS系統(tǒng)、Rsm系統(tǒng)、H

4、fq和RpoS之間的相互作用及自我調(diào)控機制；最后利用比較蛋白質(zhì)組學解析 pigX突變對穩(wěn)定期全細胞蛋白表達譜的影響，以期更好地了解PigX在G3菌株中的生物學功能。PigX生物學功能的研究不僅可以進一步了解 G3菌株生防活性的調(diào)控網(wǎng)絡，也為更好地改良G3菌株的生防活性提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）利用基因替換、同源重組策略構(gòu)建了 pigX突變體 pigX::Gm；通過比較野生型 G3和 pigX::Gm突變體蛋白酶與

5、幾丁質(zhì)酶活性、運動性、生物膜形成和抗真菌活性，發(fā)現(xiàn)PigX正調(diào)控蛋白酶、幾丁質(zhì)酶活性，以及運動性和抗真菌活性，負調(diào)控生物膜形成。通過檢測細菌提取物中PRN及培養(yǎng)物中的IAA和乙偶姻，發(fā)現(xiàn) PigX正調(diào)控 PRN產(chǎn)生，負調(diào)控 IAA和乙偶姻的合成。以上研究結(jié)果表明PigX作為G3菌株多效調(diào)控子在調(diào)節(jié)內(nèi)生菌S. plymuthica與寄主植物有益互作中發(fā)揮重要作用。
　?。?）利用 lux和 lacZ報告基因分別構(gòu)建轉(zhuǎn)錄和翻譯融合，分

6、析了 PigX調(diào)控運動性、PRN合成的分子機制。結(jié)果表明 PigX正調(diào)控鞭毛主調(diào)控子操縱子flhDC和 PRN合成基因簇 prnABCD的轉(zhuǎn)錄和翻譯，這暗示了 PigX可能通過影響 flhDC的表達調(diào)控運動性，通過增強 prnABCD的表達而正調(diào)控 PRN的合成。
　?。?）基于-lux和-lacZ的轉(zhuǎn)錄和翻譯融合分析表明 PigX與其它全局調(diào)控系統(tǒng)（子）之間存在密切的互作：A) PigX正調(diào)控 AHLs合成酶 splI和 sps

7、I的轉(zhuǎn)錄，所以可能通過影響AHLs的合成，進而影響QS系統(tǒng)；B) PigX在穩(wěn)定期負調(diào)控rsmB的轉(zhuǎn)錄，正調(diào)控rsmA的轉(zhuǎn)錄，而RsmB和RsmC則正調(diào)控pigX的轉(zhuǎn)錄和翻譯；C) PigX自我正調(diào)控；D) PigX正調(diào)控 hfq的轉(zhuǎn)錄，同時 Hfq正調(diào)控pigX的轉(zhuǎn)錄和翻譯；E) RpoS負調(diào)控pigX的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
　　（4）運用比較蛋白組學策略鑒定了 PigX在翻譯水平調(diào)控的靶蛋白，揭示了野生型 G3和 pigX::Gm突變

8、體在穩(wěn)定期（24h）蛋白表達譜的差異。MALDI-TOF/TOF MS共鑒定出了133個差異表達的蛋白點，代表著128種蛋白。與野生型 G3相比，pigX::Gm突變體中79個點蛋白豐度上升，54個下降。GO和COG功能分析表明這些蛋白參與多個生物學過程，包括能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化，氨基酸、碳水化合物、核酸、脂、無機物鹽的代謝和轉(zhuǎn)運，蛋白質(zhì)折疊，氧化脅迫，細胞包被和外膜結(jié)構(gòu)、細胞運動性及信號轉(zhuǎn)導等。在鑒定的差異蛋白點中，有15個參與碳水化合物的

9、代謝和轉(zhuǎn)運，17個與脅迫反應相關(guān)，6個為外膜通道蛋白。進一步 KEGG pathway分析顯示，多個蛋白參與糖酵解、糖異生和TCA循環(huán)等代謝途徑。其中重要差異蛋白點描述如下：
　　A) pigX突變影響外膜結(jié)構(gòu)，導致外膜通道蛋白 OmpA、OmpC和 TolC表達量下降，這可能影響細菌分泌物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。
　　B)饑餓/穩(wěn)定期保護蛋白Dps、超氧岐化酶SOD、過氧化氫酶CAT和通用應激蛋白 UspE在 pigX::Gm突變體中的

10、表達水平較野生菌都明顯下降。表型分析證實了 PigX正調(diào)控 SOD和 CAT活性，因而可能增加細菌對氧脅迫的耐受性，暗示PigX可能影響細菌的生態(tài)適應性。
　　C)鞭毛蛋白在野生型 G3中特異表達，而 flhDC轉(zhuǎn)錄抑制子 LrhA在pigX::Gm突變體中高表達。SDS-PAGE和質(zhì)譜鑒定證實了 PigX正調(diào)控鞭毛蛋白產(chǎn)生，基于-lacZ的翻譯融合分析也驗證了 PigX負調(diào)控 LrhA，正調(diào)控FlhDC。以上實驗結(jié)果表明PigX

11、可能至少部分通過影響鞭毛主調(diào)控子FlhDC及其轉(zhuǎn)錄抑制子 LrhA的表達激活鞭毛蛋白產(chǎn)生，從而正調(diào)控細菌鞭毛依賴的運動性。
　　綜上所述，PigX通過與轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)QS和轉(zhuǎn)錄后Rsm系統(tǒng)、以及Hfq和RpoS等全局調(diào)控子互作整合進入復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，在 G3菌株中在多個水平全局調(diào)控細菌的各種生理活動和行為，包括細菌分泌抗生素 PRN、植物生長素IAA和乙偶姻，進而影響細菌的生防活性和植物生長促進潛能，以及氧化應激、運動性和生物膜形成