EDAG調(diào)控GATA-1穩(wěn)定性及紅系分化的作用研究.pdf

1、紅系分化相關(guān)基因（EDAG）是造血組織特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控造血細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，在造血譜系分化平衡的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但目前對其發(fā)揮功能的作用機(jī)制研究不尚清楚。本論文以蛋白質(zhì)相互作用為基礎(chǔ)，深入研究了EDAG與紅系/巨核轉(zhuǎn)錄因子GATA-1及血液腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)NPM1的相互作用，探討EDAG對造血系統(tǒng)和白血病發(fā)生的作用機(jī)制。
　　本研究發(fā)現(xiàn)EDAG是一個(gè)新的GATA-1相互作用蛋白質(zhì)，證實(shí)EDAG與GATA-

2、1存在相互作用，并確定了它們相互作用的結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)EDAG能夠增強(qiáng)GATA-1的穩(wěn)定性，延長GATA-1蛋白質(zhì)的半衰期。構(gòu)建過表達(dá)和敲低EDAG蛋白質(zhì)的K562細(xì)胞穩(wěn)定株，證明在CHX和PMA處理的過程中EDAG能夠穩(wěn)定內(nèi)源GATA-1的蛋白質(zhì)水平，降低GATA-1降解。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EDAG能夠增強(qiáng)GATA-1的轉(zhuǎn)錄活性，提高GATA-1的DNA能力。在Epo誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞向紅系分化的過程中，

3、EDAG能夠穩(wěn)定內(nèi)源的GATA-1蛋白質(zhì)水平，EDAG敲低抑制HSP70入核促進(jìn)GATA-1被caspase3切割，并且抑制紅系分化。
　　NPM1是與白血病發(fā)生密切相關(guān)的核仁蛋白，本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)EDAG與NPM1存在相互作用，初步研究表明EDAG可能調(diào)控NPM1蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。本研究使用Co-IP的方法確定了NPM1與EDAG相互作用結(jié)構(gòu)域在NPM1的118-187aa。在CHX的處理下K562細(xì)胞過表達(dá)EDAG提高NPM1蛋白

4、質(zhì)穩(wěn)定性，用慢病毒感染的方法敲低EDAG則促進(jìn)NPM1蛋白質(zhì)的降解。在PMA誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化的過程中過表達(dá)EDAG阻止NPM1蛋白質(zhì)的下調(diào)，敲低EDAG后加速NPM1蛋白質(zhì)下調(diào)。初步的實(shí)驗(yàn)表明EDAG可抑制NPM1的泛素化。對EDAG穩(wěn)定NPM1蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義研究發(fā)現(xiàn)，在K562細(xì)胞中敲低EDAG后增加了由imatinib誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，NPM1過表達(dá)則阻止凋亡的增加。這些結(jié)果表明EDAG通過與NPM1的相互作用增強(qiáng)NPM

5、1蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，EDAG可能在白血病細(xì)胞抗凋亡的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。
　　此外，本研究還發(fā)現(xiàn)EDAG是p300的新底物，EDAG可被p300催化發(fā)生乙酰化修飾；通過免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜的方法確定EDAG存在3個(gè)乙?；稽c(diǎn)(K189,K327,K341)；乙酰化位點(diǎn)突變能夠增強(qiáng)EDAG自身穩(wěn)定性，促進(jìn)EDAG與GATA-1之間的相互作用。
　　綜上，我們發(fā)現(xiàn)EDAG可通過穩(wěn)定GATA-1穩(wěn)定性調(diào)控紅系分化，并通過調(diào)控NPM1