造血調(diào)控分子PPP2Cβ參與紅系分化及EDAG在白血病發(fā)生中的作用研究.pdf

1、紅細(xì)胞的生成受到多層次、多水平的調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄因子在紅細(xì)胞生成過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。GATA1是目前研究最為深入的紅系轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。GATA1一方面可通過(guò)翻譯后水平修飾如乙?；?、磷酸化等，進(jìn)而調(diào)控其自身轉(zhuǎn)錄活性，另一方面還可與其它多種轉(zhuǎn)錄因子形成動(dòng)態(tài)復(fù)合體，對(duì)下游基因進(jìn)行選擇性調(diào)控，進(jìn)而參與紅系分化。本研究主要圍繞GATA1的兩個(gè)相互作用蛋白PPP2Cβ與EDAG展開(kāi)研究，揭示了PPP2Cβ與GATA1相互作用并調(diào)控紅系分化的新功能

2、，并探討了EDAG在BCR-ABL及MLL-AF9誘導(dǎo)的白血病中的作用。本研究分為以下兩部分：
　　第一部分: PPP2Cβ與GATA1相互作用促進(jìn)紅系分化的研究
　　我們實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜交構(gòu)建了造血干細(xì)胞（HSC）轉(zhuǎn)錄因子相互作用網(wǎng)絡(luò)，在該網(wǎng)絡(luò)中，蛋白磷酸酶2A的催化亞基β（PPP2Cβ）是GATA1新的相互作用蛋白，提示PPP2Cβ很可能調(diào)控造血分化。本部分我們首先利用促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，

3、EPO)誘導(dǎo)臍血CD34+細(xì)胞向紅系分化，檢測(cè)了PPP2Cβ在分化過(guò)程中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平PPP2Cβ都發(fā)生明顯上調(diào)，而在分化晚期恢復(fù)正常水平，表明PPP2Cβ很可能在紅系早期分化過(guò)程中發(fā)揮重要功能。
　　進(jìn)一步我們構(gòu)建了PPP2Cβ帶Flag標(biāo)簽的表達(dá)載體，利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)GATA1和PPP2Cβ存在相互作用，并確定了PPP2Cβ結(jié)合在GATA1的N端鋅指結(jié)構(gòu)。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明，PP

4、P2Cβ能增強(qiáng)GATA1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性且能促進(jìn)GATA1下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步利用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建過(guò)表達(dá)PPP2Cβ的K562細(xì)胞穩(wěn)定株，發(fā)現(xiàn)PPP2Cβ過(guò)表達(dá)可促使K562細(xì)胞自發(fā)向紅系分化。這些結(jié)果表明PPP2Cβ可調(diào)控GATA1活性，是一種新的紅系分化調(diào)控分子。
　　第二部分:EDAG在白血病發(fā)生中的作用研究
　　紅系分化相關(guān)基因（Erythroid Differentiation Associated Gene

5、，EDAG）是我們實(shí)驗(yàn)室率先分離克隆的新基因，特異表達(dá)于造血組織，參與調(diào)控造血細(xì)胞的增殖、分化與HSC的譜系分化平衡。我們前期研究發(fā)現(xiàn)EDAG可與GATA1相互作用，通過(guò)募集p300增強(qiáng)GATA1乙?；郊稗D(zhuǎn)錄調(diào)控活性，三者形成動(dòng)態(tài)復(fù)合體，選擇性激活紅系分化相關(guān)基因，進(jìn)而促進(jìn)紅系分化。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)EDAG除了促進(jìn)紅系分化外，還可能與白血病的發(fā)生有關(guān)。本部分我們探討了EDAG在BCR-ABL誘發(fā)的CML（慢性髓系白血?。┘癕LL-A

6、F9誘發(fā)的AML（急性粒細(xì)胞白血?。┌l(fā)生中的作用。
　　我們首先對(duì)BCR-ABL逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行了包裝，獲得高滴度病毒，并制備了BCR-ABL誘發(fā)的CML小鼠模型。對(duì)BCR-ABL感染的臍血CD34+細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EDAG表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步將BCR-ABL病毒感染EDAG基因敲除小鼠和正常小鼠的骨髓細(xì)胞，進(jìn)行骨髓移植。結(jié)果顯示敲低EDAG可降低BCR-ABL誘發(fā)的CML發(fā)病率，表現(xiàn)為移植EDAG敲除小鼠骨髓細(xì)胞的受體小鼠發(fā)病時(shí)間

7、明顯晚于對(duì)照小鼠，外周血白細(xì)胞數(shù)目顯著低于對(duì)照組，這些結(jié)果表明 EDAG在BCR-ABL誘發(fā)的CML發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　此外，我們利用MLL-AF9轉(zhuǎn)基因小鼠評(píng)價(jià)了EDAG敲除在AML細(xì)胞浸潤(rùn)中的作用。在發(fā)病的MLL-AF9小鼠骨髓及脾臟中，EDAG表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步將發(fā)病的MLL-AF9轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞移植到EDAG基因敲除小鼠和野生型小鼠體內(nèi)，研究造血微環(huán)境對(duì)白血病細(xì)胞的影響，結(jié)果表明兩組小鼠在血象各項(xiàng)指標(biāo)中和外周