前列腺素E-,1-對血吸蟲病家兔肝臟纖維化形成影響的實驗研究.pdf

1、第一部分:血吸蟲病肝纖維化家免實驗模型構建 目的：建立穩(wěn)定的、類似人類肝臟纖維化自然病程的家兔血吸蟲病肝纖維化模型，了解模型動物肝纖維化形成過程，為干預性實驗用藥的時機選擇和效果觀察提供實驗依據(jù)。 方法：血吸蟲尾蚴皮膚敷貼法感染家兔，分別于感染尾蚴后4wk、6wk、8wk、10wk、12wk、16wk、20wk、24wk采用苦味酸天狼星紅和免疫組織化學方法分別動態(tài)觀察感染日本血吸蟲尾蚴后的中國大耳白兔肝臟Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠

2、原和纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)成分和含量變化，以及蟲卵肉芽腫數(shù)量、面積和肝纖維化程度。 結果：病理證實家兔血吸蟲感染成功率100％，有3只家兔在應用左旋吡喹酮殺蟲前因急性血吸蟲病死亡；完成觀察期的實驗動物肝臟纖維化模型成功率100％。感染血吸蟲尾蚴后6wk，肝臟有急性蟲卵肉芽腫形成，第8wk肉芽腫達到高峰，大部分被吸收而變?yōu)榫哂性鲋承宰兓募俳Y核性蟲卵肉芽腫并逐漸縮小。感染后20～24wk，家兔肝臟增大、呈現(xiàn)中

3、重度血吸蟲病特有的干線型纖維化。血吸蟲感染第8周后肝臟肉芽腫周圍己見少量Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維，零星地分布在擴大的匯管區(qū)以及新生肉芽腫的周圍。隨后，Ⅰ型和Ⅲ型纖維含量明顯進行性增加，肝臟纖維化程度進行性加重。Ⅰ型膠原纖維沉積的速度明顯快于Ⅲ型膠原。在纖維化形成過程中FN含量先于膠原蛋白緩慢增加，均勻分布于蟲卵肉芽腫基質和匯管區(qū)，走向與Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原相同。 結論：日本血吸蟲尾蚴感染家兔形成肝纖維化模型成功地在動物體內再現(xiàn)了人類血吸蟲

4、病相似的疾病發(fā)病過程，模型動物肝臟FN和Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原含量緩慢持續(xù)穩(wěn)定增加，為進一步進行藥物探討纖維化發(fā)病機制及抗肝纖維化治療奠定了基礎。 第二部分:前列腺素(PG)E1對肝臟星狀細胞活化影響的實驗研究 目的：探討血吸蟲病家兔肝纖維化形成過程中，靜脈應用前列腺素E1對肝臟星狀細胞(Hepaticstellatecells，HSCs)活化的影響以及過氧化物酶體增殖物活化受體γ(Peroxisomeproliferato

5、rs-activatedreceptorgamma，PPARγ)在其中的作用。 方法：血吸蟲尾蚴皮膚敷貼法感染家兔，構建肝臟纖維化模型，其中7只家兔在感染后60d開始給予PGE1(2.5μg.kg-1d-1)。至24wk透射電鏡比較HSCs超微結構變化，免疫組織化學檢測肝竇周圍平滑肌肌動蛋白(alphasmoothmuscleactin，α-SMA)表達，RT-PCR分別檢測HSCs活化表達Ⅰ型膠原前體α2(procollage

6、nⅠα2)mRNA和PPARγmRNA表達水平。 結果：健康家兔肝臟高水平表達PPARγmRNA(OD.，18.53±5.27)。血吸蟲病家兔肝臟纖維化形成過程中HSCs活化增加，收縮特性相關的α-SMA表達增強(強陽性視野數(shù)34)，procollagenⅠα2mRNA表達增加(OD.，27.47±5.20)，而PPARγmRNA表達水平明顯降低。外源性PGE1可以抑制HSCs活化，顯著降低α-SMA(強陽性視野數(shù)5)和proc

7、ollagenⅠα2mRNA(OD.，13.16±7.86)表達(P＜0.01)；PGE1干預能促進PPARγmRNA水平上升(OD.，9.89±2.16)，與對照組(OD.，3.45±1.21)比較，P＜0.05。 結論：HSCs活化是血吸蟲病家兔肝纖維化形成的重要環(huán)節(jié)。PGE1可以有效地抑制抑制HSCs活化，這種作用至少部分地是通過增強PPARγ表達實現(xiàn)的。 第三部分:前列腺素(PG)E1對細胞外基質代謝影響的實驗研

8、究 目的：探討前列腺素E1對血吸蟲病家兔肝臟細胞外基質(Extracellularmatrix，ECM)基因表達、成熟和降解的影響。 方法：血吸蟲尾蚴皮膚敷貼法感染14只家兔，其中7只家兔于感染后60d開始靜脈應用PGE1(2.5μg/kg·d-1)至24wk。RT-PCR方法檢測肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原，MMP1、MMP13，TIMP1以及HSP47基因mRNA表達水平；苦味酸天狼星紅染色，偏振光顯微鏡觀察Ⅰ、Ⅲ型成熟

9、膠原含量；免疫組織化學方法檢測纖維連接素(Fibronectin，F(xiàn)N)表達。 結果：與健康家兔比較，血吸蟲病家兔肝纖維化形成過程中Ⅰ、Ⅲ型膠原基因表達水平(OD.，3.92±3.66和3.17±0.32)和成熟纖維含量(面積比：49.25±9.71和9.66±3.59)均明顯增加；FN表達水平增加10余倍(OD.，43.41±14.62，P＜0.01)；HSP47mRNA表達增加6倍(OD.，0.43±0.07，P＜0.05)

10、。MMP1(OD.，0.41±0.14)、MMP13(OD.，0.37±0.20)，TIMP1(OD.，0.72±0.15)mRAN表達水平同向升高。外源性PGE1可以顯著降低膠原Ⅰ、ⅢmRNA(OD.，5.79±1.26和5.34±1.08，與對照組比較P＜0.01)和成熟纖維含量(面積比：13.38±4.24和6.23±8.92，與對照比較P＜0.01)；FN表達顯著降低(OD.，4.19±3.26，與對照組比較，P＜0.01)。P

11、GE1可以顯著抑制分子伴侶HSP47mRNA表達(OD.，0.12±0.02，與對照組比較，P＜0.05)。PGE1在抑制TIMP1mRAN(OD.，0.28±0.13)表達的同時，刺激增強MMP1mRNA(OD.，0.94±0.25)、MMP13(OD.，0.87±0.38)mRNA表達(P＜0.01)。 結論：PGE1可以通過下調Ⅰ、Ⅲ型膠原基因、HSP47基因表達水平，降低TIMP1基因并促進MMP1、MMP13基因表達，

12、在基因表達、成熟和降解等多環(huán)節(jié)減少ECM沉積。 第四部分:前列腺素(PG)E1對細胞因子及其受體表達影響的實驗研究 目的：探討肝臟纖維化形成過程中細胞因子及其受體表達的變化，以及外源性前列腺素E1(PGE1)對其表達的影響。 方法：血吸蟲尾蚴皮膚敷貼法感染家兔，構建14只肝臟纖維化模型，其中7只家兔在感染后60d開始給予PGE1(2.5μg/kg.d-1)至24wk。RT-PCR檢測PDGF-BmRNA、TGF-

13、β1mRNA，原位雜交方法標記IFN-γmRNA表達，免疫組織化學方法半定量了解TNF-α表達情況，同時westernblotting方法測定肝臟組織中PDGFR-β、TβR-Ⅰ表達水平。 結果：血吸蟲病纖維化形成過程中，除纖維化保護性細胞因子IFN-γmRNA水平下降外，PDGFBmRNA(OD.，0.81±0.27)，TGF-β1mRNA(OD.，0.77±0.14)及其相應受體PDGFR-β(OD.，0.46±0.07)、

14、TβR-Ⅰ(OD.，0.63±0.28)蛋白水平均顯著升高(P＜0.01)，TNF-α蛋白表達(陽性細胞數(shù)：52.31±16.18)亦增高明顯。外源性PGE1治療后PDGFBmRNA(OD.，0.39±0.15)，TGF-β1mRNA(OD.，0.21±0.83)及其相應受體PDGFR-β(OD.，0.21±0.11)、TβR-Ⅰ(OD.，0.16±0.09)蛋白水平增高趨勢都受到明顯遏制(P＜0.01)，兩種受體水平分別較對照組下降7