體外培育牛黃復(fù)方制劑對(duì)血吸蟲(chóng)病家兔肝纖維化組織及門靜脈血管病變影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的 通過(guò)對(duì)血吸蟲(chóng)病家兔肝纖維化組織及門靜脈壁病理形態(tài)學(xué)觀察，F(xiàn)N、LN、ERK1/2及C-fos表達(dá)的組織化學(xué)和分子生物學(xué)研究，初步探討體外培育牛黃復(fù)方制劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性血吸蟲(chóng)病家兔肝纖維化門靜脈高壓癥的影響，觀察體外培育牛黃復(fù)方制劑(In-vitrocultivatedcalculusboviscompoundpreparation，ICCBco)對(duì)肝纖維化的治療作用，為進(jìn)一步探討其抗肝纖維化作用機(jī)制及選擇有效治療肝纖維化藥物

2、。 材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備：選用成年雄性中國(guó)大耳白兔20只，體重1.5～2.2kg。隨機(jī)取6只作為健康對(duì)照組；其余14只家兔采用腹部皮膚敷貼法感染血吸蟲(chóng)，籠養(yǎng)至40天時(shí)隨機(jī)分為兩組，模型對(duì)照組7只，ICCBco干預(yù)7只。其中ICCBco干預(yù)組加以ICCBco喂養(yǎng)，600mg/kg/d，一次喂服。 2.標(biāo)本采集：家兔飼養(yǎng)至90d時(shí)，實(shí)驗(yàn)家兔經(jīng)4％戊巴比妥鈉50mg/1kg，腹腔注射麻醉，采集標(biāo)本，保存?zhèn)錂z

3、。 3.研究方法 (1)ICCBco肝組織及門靜脈壁病理形態(tài)學(xué)觀察：采用HE染色，三色膠原染色及透射電鏡觀察各組組織學(xué)、膠原含量及組織病理學(xué)變化。 (2)ICCBco肝組織及門靜脈壁Fibronectin及Laminin表達(dá)的研究：采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)各組肝纖維化組織及門靜脈壁組織切片進(jìn)行FN，LN染色，顯微圖像分析儀分析FN及LN含量。 (3)ICCBco對(duì)肝纖維化門脈高壓癥門靜脈壁ERK1/2及C-

4、fos表達(dá)的研究：采用Westernblot檢測(cè)各組冢兔門靜脈血管組織ERK1/2活性及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組家兔門靜脈血管壁c-fos表達(dá)，探討ICCBco對(duì)血及蟲(chóng)病肝纖維化門靜脈高壓癥血管病變的影響。 結(jié)果 1.病理學(xué)證實(shí)90d時(shí)模型組家兔肝表面呈灰褐色，組織變硬，被膜腫脹肝臟有大量肝臟表面密布灰色或灰黃色粟粒樣蟲(chóng)卵結(jié)節(jié)，肝臟大量膠原沉積，符合肝硬化基本病理改變，肝纖維化造模成功。 2.ICCBco肝組織及門

5、靜脈壁病理形態(tài)學(xué)觀察： 肉眼觀察：模型組家兔肝表面呈灰褐色，組織變硬，被膜腫脹，肝臟表面密布灰色或灰黃色粟粒樣蟲(chóng)卵結(jié)節(jié)，伴有的可見(jiàn)少量或中量腹水，脾臟腫大明顯，門靜脈及內(nèi)臟靜脈系統(tǒng)充血、擴(kuò)張；ICCBCO治療組，肝臟色呈暗紅色，表面只見(jiàn)散在蟲(chóng)卵結(jié)節(jié)，沒(méi)有腹水，脾腫大不明顯，門靜脈及內(nèi)臟靜脈充血擴(kuò)張不明顯。 HE染色：模型對(duì)照組家兔肝臟匯管區(qū)有大量蟲(chóng)卵肉芽腫形成，纖維組織增生明顯，以匯管區(qū)為中心逐漸向肝小葉延伸，肝竇壁增厚

6、，壓迫竇腔，并包饒肝細(xì)胞；大量膠原纖維形成條束狀纖維隔，重新分隔肝小葉；ICCBco干預(yù)組沒(méi)有出現(xiàn)明顯的纖維化和假小葉，肉芽腫較小且數(shù)目少；肝臟纖維結(jié)構(gòu)存在，基本維持肝小葉結(jié)構(gòu)，纖維成份局限于匯管區(qū)。 Pollak三色染色：ICCBco干預(yù)組：肝匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞間膠原纖維較模型組明顯減少，門靜脈平滑肌細(xì)胞間門靜脈平滑肌細(xì)胞間見(jiàn)少量線狀膠原纖維，與模型組比較明顯減少。模型對(duì)照組肝組織及門靜脈膠原纖維含量與健康對(duì)照組比較有顯著差異性

7、，P＜0.01，ICCBco干預(yù)組肝組織及門靜脈膠原纖維含量明顯減少，與模型對(duì)照組比較有顯著差異性，P＜0.01。 透射電鏡結(jié)觀察：模型對(duì)照組肝竇內(nèi)皮受損嚴(yán)重，細(xì)胞大多崩解，竇內(nèi)可見(jiàn)肥大細(xì)胞，中性粒細(xì)胞、槳細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)膽管擴(kuò)張，肝細(xì)胞肝竇面的微絨毛減少或斷裂，肝竇呈毛細(xì)血管化；肝細(xì)胞不同程度損傷，形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)聚積，顏色變淡，胞槳內(nèi)富含溶酶體及吞噬體，線粒體基質(zhì)呈絮狀變性，嵴消失或減少，內(nèi)織網(wǎng)擴(kuò)張，粗面內(nèi)織網(wǎng)短

8、而少，糖元較豐富；ICCBco 干預(yù)組家兔肝細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，核周圍間隙清昕，粗面內(nèi)織網(wǎng)排隊(duì)列整齊。 3.ICCBco肝組織及門靜脈壁Fibronectin及Laminin表達(dá)的研究： 顯微圖像分析及統(tǒng)計(jì)結(jié)果：ICCBco治療組組FN表達(dá)(OD值)與模型對(duì)照組比較有顯著差異，P＜0.0001。ICCBco治療組肝組織及門靜脈壁C組LN表達(dá)(OD值)明顯減少，與模型對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。

9、 4.ICCBco對(duì)肝纖維化門脈高壓癥門靜脈壁ERK1/2及C-fos表達(dá)的研究：門靜脈壁ERK1/2表達(dá)：血吸蟲(chóng)病模型組門靜脈壁ERK1/2活性較正常對(duì)照明顯增高一倍以上(P＜0.01)。ICCBco干預(yù)組的ERK1/2活性較血吸蟲(chóng)病模型組明顯降低。 門靜脈壁C-fos表達(dá)：ICCBco干預(yù)組與血吸蟲(chóng)病家兔組門靜脈壁c-fos表達(dá)與模型對(duì)照組相比c-fos表達(dá)明顯減弱(P＜0.01)。 結(jié)論 1.通過(guò)病理形態(tài)

10、學(xué)觀察，說(shuō)明ICCBco可以保護(hù)和阻抑血吸蟲(chóng)病肝纖維化組織及門靜脈壁病理變化的形成進(jìn)程，有抗血吸蟲(chóng)病肝纖維化作用。 2.ICCBco能抑制肝組織及門靜脈壁Fibronectin及Laminin表達(dá)，降低細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，發(fā)揮抗肝纖維化作用。 3.ICCBco干預(yù)組的ERK1/2活性較血吸蟲(chóng)病模型組明顯降低。血吸蟲(chóng)病組門靜脈壁pERK1/2光密度值較ICCBco干預(yù)組和正常對(duì)照組高2～3倍(P＜0.01)。說(shuō)明ERKi/2