基于survivin的新型“模擬病毒”瘤苗的分子設計及抗腫瘤免疫的研究.pdf

1、惡性腫瘤是世界上致死率最高的疾病之一，由于大多數(shù)的惡性腫瘤在診斷早期就發(fā)生了微轉(zhuǎn)移，所以當前基于手術(shù)切除、化療、放療的治療方案仍然不能完全控制其復發(fā)率。因此，尋找新的輔助治療方法迫在眉睫。近年來，以激活細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)為主的免疫治療策略在惡性腫瘤的綜合治療中發(fā)揮了重要作用。與其它傳統(tǒng)的治療方法相比較，免疫治療能誘導自身的腫瘤特異性免疫應答，不但可以識別和清除腫瘤細胞，而且還可以誘

2、發(fā)免疫記憶，阻止腫瘤的復發(fā)。 Survivin是1997年發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制因子家族(inhibitor of apoptosis protein，IAP)的一個重要成員。研究表明：(1)該蛋白是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子，具有抑制細胞凋亡和維持細胞有絲分裂的雙重功能。Survivin過度表達能顯著抑制由各種刺激所誘導的凋亡，而下調(diào)survivin的表達則顯著增加細胞凋亡指數(shù)并導致細胞有絲分裂障礙；(2)Survivin在

3、正常的終末分化組織中幾乎不表達，但在幾乎所有被研究的惡性腫瘤組織中呈陽性表達，如結(jié)腸癌(>80％)、乳腺癌(70％-98％)、胰腺癌(88％)、胃癌(>60％)、食道癌(80％)、肝癌(70％)等常見腫瘤均高表達survivin，故該蛋白被視為最具腫瘤特異性的腫瘤共享抗原；(3)據(jù)統(tǒng)計分析，survivin表達水平與腫瘤惡性程度成正相關(guān)；如果腫瘤組織高表達survivin，腫瘤細胞凋亡指數(shù)下降，對放化療的耐受性增強、預后差。相反，如果腫

4、瘤組織低表達或不表達survivin，通常對放化療敏感、預后良好。故該蛋白被視為最具腫瘤特異性的治療靶標。 另外在許多抗腫瘤研究中，將IL-15作為免疫佐劑，可以上調(diào)T細胞Bcl-2和Bcl-xl的表達，增強效應細胞抗凋亡能力，成功地誘導出長效的抗原特異性的記憶性CTL，對抗腫瘤發(fā)揮了重要作用。因此，本研究基于以往的基礎，將陽離子穿膜肽HIV-Tat<,49-57>與來源于survivin的H2-k<'d>限制性CTL表位肽su

5、rvivin<,85-93>設計成融合肽的形式，利用正負電荷吸引原理，以富含正電荷的陽離子融合肽包裝富含負電荷的IL-15 DNA佐劑，形成模擬天然病毒結(jié)構(gòu)的瘤苗形式，故我們將這種形式的疫苗命名為“模擬病毒”瘤苗。 我們希望該“模擬病毒”瘤苗能將所攜帶的腫瘤抗原表位肽在體內(nèi)有效地激發(fā)CTL應答，達到殺傷腫瘤細胞的效應，從而抑制腫瘤的生長。研究發(fā)現(xiàn)，在適當NaCl濃度的溶液中，一定比例的融合肽與DNA能產(chǎn)生小而均勻的顆粒性肽-DN

6、A復合物，是一種類似于病毒的結(jié)構(gòu)，使腫瘤抗原多肽的免疫原性和DNA的佐劑效應有效結(jié)合，形成很好的復合物，避免了酶的降解，使得該疫苗在體內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性。細胞轉(zhuǎn)染和抗原呈遞實驗結(jié)果顯示，“模擬病毒”瘤苗能有效轉(zhuǎn)染細胞，表達所攜帶的基因，并成功呈遞抗原表位肽。 在Babl/c小鼠動物模型中，我們用“模擬病毒”瘤苗免疫動物，可誘導產(chǎn)生CTL活性，而且能促進CTL分泌IFN-γ。含IL-15質(zhì)粒的“模擬病毒”瘤苗比含空質(zhì)粒的“模擬病毒

7、”瘤苗激發(fā)出更多分泌IFN-γ的CTL，而PBS刺激組不能激發(fā)分泌IFN-γ的CTL。在細胞毒實驗中，含IL-15質(zhì)粒的“模擬病毒”瘤苗激發(fā)出的CTL的殺傷活性最高，明顯高于含空質(zhì)粒的“模擬病毒”瘤苗激發(fā)出的CTL殺傷活性，而PBS刺激組不能激發(fā)具有細胞毒活性的CTL。這些結(jié)果均提示，含IL-15質(zhì)粒的“模擬病毒”瘤苗能在體內(nèi)有效激發(fā)CTL，并高效特異地殺傷結(jié)腸癌CT26靶細胞。為了進一步評價“模擬病毒”瘤苗在體內(nèi)的抗瘤效應，我們采用B

8、abl/c小鼠的荷瘤模型，腫瘤采用結(jié)腸癌細胞CT26。研究結(jié)果證實，含有IL-15的“模擬病毒”瘤苗免疫組中小鼠的腫瘤生長速度明顯低于對照組，而且生存率也相應提高。結(jié)果提示，含有IL-15的“模擬病毒”瘤苗能在體內(nèi)有效抑制腫瘤的生長，起到較好的保護作用。 綜上所述，為了尋求新型的腫瘤免疫治療策略，本研究以survivin為靶分子，構(gòu)建了基于survivin的新型“模擬病毒”瘤苗，并對該瘤苗進行了的抗瘤機制和效應的研究。研究在體外

9、制備基于survivin的新型“模擬病毒”瘤苗；用掃描電鏡和免疫印跡(Western blot)進行鑒定；流式細胞術(shù)研究其抗原呈遞；酶聯(lián)免疫斑點試驗(Enzyme linkedimmunospot assay，ELISPOT)和標準<'51>Cr釋放試驗分別檢測瘤苗所誘導的特異性CTL活性；并對Babl/c小鼠荷瘤模型進行免疫學效應評價。研究結(jié)果提示：掃描電鏡和免疫印跡證實“模擬病毒”瘤苗制備成功，并能有效介導“模擬病毒”瘤苗所攜帶基因

10、的表達；流式細胞術(shù)檢測證明“模擬病毒”瘤苗能成功呈遞相關(guān)腫瘤表位抗原肽；ELISPOT和標準<'51>Cr釋放試驗顯示能在體內(nèi)有效激發(fā)抗原特異性CTL效應，可誘導CTL產(chǎn)生IFN-γ等細胞因子，并對結(jié)腸癌細胞系CT26有明顯的殺傷毒性；腫瘤治療實驗證實“模擬病毒”瘤苗能有效抑制腫瘤的生長速度、提高荷瘤動物的生存率。研究結(jié)果充分說明基于survivin的“模擬病毒”瘤苗能有效激發(fā)出特異性CTL應答，并在荷瘤動物模型中有效抑制結(jié)腸癌細胞CT