肌動蛋白結(jié)合蛋白Transgelin與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系.pdf

1、背景與目的：
　　 在世界范圍內(nèi)癌癥死因排序中，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)居第3位，而90％的結(jié)直腸癌病人死于腫瘤轉(zhuǎn)移。目前認(rèn)為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞通過遺傳及表觀遺傳途徑獲得一系列特殊生物學(xué)功能的多因素、多步驟的過程。與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因相繼被發(fā)現(xiàn)，以乳腺癌為例，檢測轉(zhuǎn)移基因的診斷試驗已經(jīng)初步顯示出這些基因在預(yù)后評估及治療選擇中的作用。然而，轉(zhuǎn)移基因的診斷試驗在結(jié)直腸癌的預(yù)后評估中仍未被廣泛應(yīng)用，TN

2、M分期仍然是目前評估病人預(yù)后的主要手段。
　　 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是區(qū)分I/II期與III期結(jié)直腸癌的一個重要標(biāo)志，也是治療方案選擇的一個重要指標(biāo)。然而，是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移通常需手術(shù)后才能確定，且往往受到手術(shù)摘除的淋巴結(jié)數(shù)目的影響。這意味著使用這種分期方法十分容易低估(understage)病人的腫瘤分期，進(jìn)而影響下一步治療方案的選擇及病人的預(yù)后。因此，建立分子學(xué)分期系統(tǒng)(molecular staging)有助于更準(zhǔn)確的進(jìn)行預(yù)后評估及

3、治療選擇，并且已逐漸成為腫瘤防治的一個主流方向。本研究通過比較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的結(jié)直腸癌原發(fā)灶中腫瘤細(xì)胞的蛋白表達(dá)差異，并通過質(zhì)譜分析獲得蛋白質(zhì)序列，以期發(fā)現(xiàn)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白標(biāo)志物，為預(yù)防及控制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移提供分子基礎(chǔ)。
　　 此外，在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，腫瘤細(xì)胞必需首先侵襲突破細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)入血液或淋巴循環(huán)，并以低密度的腫瘤細(xì)胞數(shù)量在腫瘤微環(huán)境外生存，產(chǎn)生抵抗Anoikis凋亡(細(xì)胞脫離細(xì)胞基質(zhì)而進(jìn)入程序性死

4、亡)的能力，最終到達(dá)靶器官，并定植增生形成轉(zhuǎn)移灶。目前認(rèn)為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移播散能力的重要途徑。本研究在通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性和陽性的結(jié)直腸癌標(biāo)本的基礎(chǔ)上，對新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移標(biāo)志物，肌動蛋白結(jié)合蛋白Transgelin進(jìn)行了進(jìn)一步的生物學(xué)功能分析，以了解Transgelin在結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中所起的作用，以及Transgelin與E

5、MT的關(guān)系，為進(jìn)一步治療干預(yù)提供新的靶點。本研究分兩部分：
　　 第1部分：結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 第2部分：Transgelin調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移
　　 方法：
　　 第1部分：本研究采用激光顯微切割(laser capture microdissection，LCM)從冰凍切片上獲得結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行蛋白提取及熒光定量標(biāo)記，進(jìn)而通過雙向差異凝膠電泳(two-dimen

6、sional difference gel electrophoresis，2D-DIGE)，比較12例淋巴結(jié)陰性及12例淋巴結(jié)陽性的結(jié)直腸癌原發(fā)灶中腫瘤細(xì)胞的蛋白表達(dá)差異，并通過質(zhì)譜分析獲得蛋白質(zhì)序列。在結(jié)直腸癌組織芯片上進(jìn)行Transgelin免疫組織化學(xué)染色，明確Transgelin在淋巴結(jié)陰性和陽性的結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的表達(dá)水平。
　　 第2部分：利用RNAi技術(shù)，通過microRNA靶向下調(diào)(knockdown) Tra

7、nsgelin表達(dá)，建立HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD結(jié)腸癌穩(wěn)定細(xì)胞系及相應(yīng)的對照細(xì)胞系，分析細(xì)胞的體外侵襲能力、細(xì)胞集落形成能力、抵抗Anoikis凋亡的能力，以及Transgelin與EMT的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過LCM/2D-DIGE獲得的結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常粘膜細(xì)胞的蛋白點表達(dá)豐度的中位技術(shù)變異常數(shù)分別為9.37％和10.09％，根據(jù)這一數(shù)值計算，要檢出不同組之間蛋白表達(dá)差異

8、達(dá)到2倍以上的蛋白點，并維持Ⅰ類錯誤概率少于0.05及檢驗效能達(dá)到80％，每實驗組至少需要10例樣本。
　　 2.每張2D膠上平均獲得2100個蛋白點，其中980個蛋白點的膠與膠之間匹配率達(dá)到90％以上，16個蛋白點在淋巴結(jié)陰性和陽性的結(jié)直腸癌細(xì)胞中存在差異表達(dá)并可能作為潛在的轉(zhuǎn)移標(biāo)志物。質(zhì)譜分析鑒定出6個蛋白點，其中3個為肌動蛋白結(jié)合蛋白Transgelin的不同亞型，Transgelin作為單一標(biāo)志物預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的曲線下面

9、積(AUC)達(dá)86.8％(P=0.002)。
　　 3.免疫組織化學(xué)染色在結(jié)直腸癌組織芯片(共94例)中證實，Transgelin在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的陽性表達(dá)較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者更常見(P=0.036)。
　　 4.根據(jù)8號染色體短臂雜合子缺失(LOH)和雜合子保留(ROH)將結(jié)直腸癌標(biāo)本分為兩組，通過LCM/2D-DIGE發(fā)現(xiàn)89個蛋白點在兩組之間呈差異表達(dá)。質(zhì)譜分析鑒定出26個蛋白點，其中14個蛋白點在

10、8p LOH標(biāo)本中高表達(dá)，12個蛋白點呈低表達(dá)。在14個高表達(dá)的蛋白點中，有2個點被鑒定為Transgelin。
　　 5.在結(jié)直腸癌標(biāo)本及相應(yīng)的正常粘膜之間的差異蛋白質(zhì)組分析中，發(fā)現(xiàn)424個蛋白點呈差異表達(dá)，質(zhì)譜分析鑒定出56個蛋白點，其中24個蛋白點在結(jié)直腸癌標(biāo)本中高表達(dá)，32個蛋白點低表達(dá)。
　　 6.利用miRNA技術(shù)靶向下調(diào)Transgelin表達(dá)，建立HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD結(jié)

11、腸癌穩(wěn)定細(xì)胞系，其Transgelin mRNA及蛋白質(zhì)水平較相應(yīng)的對照穩(wěn)定細(xì)胞系下降80～90％。
　　 7.下調(diào)Transgelin使HCT116細(xì)胞的侵襲能力下降>50％(P<0.01)，SW480細(xì)胞的侵襲能力下降27％(P<0.01)。轉(zhuǎn)染TAGLN突變體質(zhì)粒使Transgelin重新恢復(fù)表達(dá)后，HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD細(xì)胞的體外侵襲能力分別上升57％和50％(P<0.01)。
　

12、　 8.HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD細(xì)胞分別較相應(yīng)的對照細(xì)胞HCT116CTRL和SW480CTRL的集落形成數(shù)目減少55％和40％(P<0.01)。
　　 9.誘導(dǎo)Anoikis凋亡后，HCT116TAGLN-KD和SW480TAGLN-KD細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例分別為相應(yīng)的對照細(xì)胞系的1.4倍和1.8倍(P<0.01)，將細(xì)胞重新接種到常規(guī)培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，HCT116TAGLN-KD

13、和SW480TAGLN-KD細(xì)胞的存活數(shù)量僅為相應(yīng)對照細(xì)胞系的60～70％(P<0.01)。
　　 10.在HCT116細(xì)胞中，下調(diào)Transgelin能促進(jìn)上皮標(biāo)志物occludin的表達(dá)，降低間質(zhì)標(biāo)志物vimentin和fibronectinl的表達(dá)；在SW480細(xì)胞中，下調(diào)Transgelin僅降低fibronectinl的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用LCM/2D-DIGE定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜

14、分析能發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的結(jié)直腸癌之間細(xì)微的蛋白質(zhì)表達(dá)差異。
　　 2.參與腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移的蛋白絕大部分是不相同的。
　　 3.肌動蛋白結(jié)合蛋白Transgelin在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的結(jié)直腸癌中較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者明顯上調(diào)，在染色體8p LOH的結(jié)直腸癌中與8p ROH相比亦呈上調(diào)趨勢，但在全部結(jié)直腸癌標(biāo)本與正常粘膜的比較中，則無明顯表達(dá)差異。
　　 4.下調(diào)Transgelin降低HCT116和