復(fù)雜多并指(趾)畸形遺傳定位及致病突變分析視網(wǎng)膜母細胞瘤中RB1基因致病突變檢測.pdf

1、非綜合征型并指(趾)畸形是人類最常見的肢端畸形，多呈常染色體顯性遺傳。Temtamy與McKusick按臨床表現(xiàn)將非綜合征型并指(趾)分為五型。其中Ⅳ型并指(syndactyly type Ⅳ，SD4；MIM186200)又稱Haas型并指，主要表現(xiàn)為雙側(cè)完全性皮膚并指，多伴有第6根掌骨及手指多指現(xiàn)象，常常由于筋腱攣縮整個手呈杯狀結(jié)構(gòu)，但不存在骨性融合；通常下肢受累較輕，偶見伴發(fā)脛側(cè)半肢畸形。三節(jié)指節(jié)拇指——多并指綜合征(triphal

2、angeal thumb-Polysyndactyly syndrome，TPTPs；MIM174500)是一種呈常染色體顯性遺傳的肢端畸形，表現(xiàn)為在第1指即大拇指的位置出現(xiàn)一個或多個具有三節(jié)指節(jié)的類似大拇指結(jié)構(gòu)，同時存在第3—5指全并指或第4—5指并指，而第2指往往受累較輕；通常下肢受累較輕。 在胚胎早期肢端發(fā)育過程中，極化活性區(qū)(zone of polarizing activity，ZPA)分泌的Shh蛋白決定了指趾數(shù)目及

3、形態(tài)，而人類SHH基因位于染色體7q36區(qū)域。人類染色體7q36區(qū)域與肢端發(fā)育密切相關(guān)，目前定位于此的肢端畸形有：軸前多指/三節(jié)指節(jié)拇指(preaxial polydactyly/triphalangeal thumb，PPD/TPT；MIM174500)，TPTPS，SD4及脛側(cè)半肢—多并指—三指節(jié)拇指綜合征(tibial hemimelia-Polysyndactyly-Triphalangeal thumbs syndrome，T

4、HPTTS；MIM188770)，無手足畸形(acheiropodia，ACHR；MIM200500)，肢胸綜合征(acropectoral syndrome，ACRPS；MIM605967)。其中PPD/TPT，TPTPS及THPTTS都存在三指節(jié)拇指的表型。有趣的是，1999年，Heus等人將PPD/TPT致病基因的關(guān)鍵區(qū)域縮小到450kb并排除了SHH基因。Lettice等通過比較基因組和轉(zhuǎn)基因動物的遺傳定位分析實驗發(fā)現(xiàn)，此區(qū)域內(nèi)

5、Lmbr1/C7orf2(limb region 1)基因第5內(nèi)含子中存在大約800bp的ZPA調(diào)控序列(ZPA regulatory sequence，ZRS)，在它控制下的LacZ報告基因在肢芽后緣ZPA區(qū)域有特異性表達。隨后，研究人員在8個人類PPD/TPT家系受累個體，3個PPD突變鼠模型及3個攜帶多趾表型的貓的ZRS內(nèi)發(fā)現(xiàn)了不同的點突變，證實了ZRS作為SHH增強子在PPD/TPT中的致病作用。在一個泰國TPTPS家系中，TP

6、TPS表型患者、SD4伴脛側(cè)半肢畸形表型患者共存的事實提示，TPT、TPTPS、SD4和THPTTS可能有著相似的遺傳致病機制。 拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)是指基因組中>1kb的DNA片段存在拷貝數(shù)目變化的現(xiàn)象，通常包括插入、缺失和重復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，CNV在基因組中普遍存在，與每300bp就可出現(xiàn)一次的單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)相比，C

7、NV所涉及的DNA序列范圍更為廣泛，大概覆蓋12％的人類基因組的序列。CNV與人類疾病發(fā)生密切相關(guān)，當基因組中由于CNV的存在，引起一些劑量敏感基因發(fā)生缺失、重復(fù)或者結(jié)構(gòu)完整性破壞時，就會導(dǎo)致基因組疾病(genomic disorder)的發(fā)生。 本研究以6個中國人TPTPS/SD4家系為對象，家系1的患者具有典型的TPTPS手部畸形，家系2、3、4、6中TPTPS/SD4表型并存，家系5表現(xiàn)為典型的SD4。針對7q36區(qū)域，在

8、4個家系中進行兩點連鎖分析，結(jié)果當θ=0時，在位于LMBR1基因內(nèi)的遺傳標記TG處獲得最大累計LOD值為17.32，其中家系1為9.52，家系2為3，72，家系3為2.65，家系4為1.43，肯定連鎖。首次在中國人TPTPS/SD4家系中確認了TPTPS/SD4致病基因定位于染色體7q36。通過單倍型分析將TPTPS/SD4致病基因定位至微衛(wèi)星標記AGAA至AATT之間約647kb、不包含SHH基因的范圍內(nèi)。 前期工作中，對TP

9、TPS/SD4連鎖區(qū)域內(nèi)的候選基因及10個物種間高度保守的非編碼序列(包括ZRS)進行測序，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)致病性序列改變。本研究中，通過回顧分析測序圖譜，發(fā)現(xiàn)患者當中位于高度保守非編碼區(qū)4內(nèi)和ZRS內(nèi)的兩個SNP(rs11976306，rs10254391)存在等位基因不平衡現(xiàn)象；對更多患者和家系內(nèi)正常個體的測序結(jié)果顯示，該現(xiàn)象與疾病表型共分離，提示在該區(qū)域內(nèi)可能存在與TPTPS/SD4相關(guān)的DNA拷貝數(shù)增加。通過實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)6

10、個TPTPS/SD4家系中都存在ZRS拷貝數(shù)增加，并應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)直接在患者間期核中觀察到了該段DNA重復(fù)現(xiàn)象。Ssq小鼠的轉(zhuǎn)基因插入位點也存在包含鼠ZRS在內(nèi)的24kb的DNA重復(fù)，進一步證明了ZRS拷貝數(shù)增加的致病性。 本研究在647kb的TPTPS/SD4連鎖范圍內(nèi)，綜合運用實時定量PCR技術(shù)和Affymetrix SNP 6.0芯片，對家系1—6患者的重復(fù)突變斷端邊界進行了精細定位，并據(jù)此成功克隆了家系1、3和5的

11、斷裂接合片段。根據(jù)以上分析，家系1、3、5患者的重復(fù)突變范圍確定為：144859bp、216761bp和324189bp；而家系2、4、6患者的DNA最小重復(fù)范圍約為379kb、294kb和398kb。 分析家系1、3、5患者重復(fù)突變斷端區(qū)域基因組序列及結(jié)構(gòu)特征，提出家系1患者重復(fù)突變的形成機制可能是非等位基因同源重組(nonallelic homologous recombination，NAHR)和非同源斷端連接機制(non

12、homologous end—joining，NHEJ)或復(fù)制叉停頓和模板轉(zhuǎn)位機制(fork stalling and template switching，F(xiàn)osTes)。家系3和家系5患者重復(fù)突變的形成機制可能是非同源斷端連接機制(nonhomologous end—joining，NHEJ)。 總之，本研究在6個中國人TPTPS/SD4家系中確認了TPTPS/SD4致病基因位于染色體7q36區(qū)域一個約647kb的區(qū)間內(nèi)；發(fā)

13、現(xiàn)TPTPS/SD4致病突變是包含ZRS在內(nèi)的DNA重復(fù)突變；患者表型嚴重程度與重復(fù)片段大小無直接關(guān)系；基于對本研究中6個TPTPS/SD4家系中患者表型的分析及分子遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)，結(jié)合文獻分析，提出PPD/TPT、TPTPS、SD4和THPTTS是一個連續(xù)的表型譜的概念。 RB1(Retinoblastoma 1，RB1；MIM 180200)基因突變是視網(wǎng)膜母細胞瘤發(fā)生中的起始基因缺陷。視網(wǎng)膜母細細胞瘤分遺傳性和非遺傳性兩種，幾

14、乎所有的雙側(cè)和家族性患者都是遺傳性視網(wǎng)膜母細胞瘤。只有15％的單側(cè)視網(wǎng)膜母細胞瘤患者是遺傳性的，其余都是非遺傳性的散發(fā)病例。遺傳性視網(wǎng)膜母細胞瘤患者攜帶生殖系RB1基因突變，RB1基因生殖系突變的檢測有助于遺傳性視網(wǎng)膜母細胞瘤患者的確認和其高危親屬中攜帶者的檢出，從而提供相應(yīng)的遺傳咨詢。迄今，已發(fā)現(xiàn)了近600種來自不同種族背景的RB1基因突變，根據(jù)一項RB1基因突變的meta分析報告，來自中國人群的突變僅有22種。 本研究中，首

15、先應(yīng)用變性高效液相色譜(High-Performance Liquid Chromatography，DHPLC)或高分辨熔解曲線分析(High Resolution Melting，HRM)做為初篩工具，結(jié)合測序驗證，對31名中國漢族視網(wǎng)膜母細胞瘤患者進行了RB1基因外顯子及鄰近內(nèi)含子區(qū)域的微小缺陷(micro—lesion)的突變篩查。對于在上述篩查中的陰性個體，進行了多重連接探針擴增分析(multiple ligation pro

16、be amplification，MLPA)，對RB1基因外顯子或包含整個RB1基因的拷貝數(shù)變異進行檢測。對基因組DNA水平上RB1基因突變檢測陰性個體，進行了轉(zhuǎn)錄本分析，檢測存在于內(nèi)含子當中的剪接位點突變或大的重組造成的剪接改變。 在19名遺傳性視網(wǎng)膜母細胞瘤患者中發(fā)現(xiàn)了18種RB1基因突變，其中10個為國際首報。本研究發(fā)現(xiàn)的新突變包括6個移碼突變(p.Leu647HisfsX10，p.Asn598LysfsX13，p.Gly

17、310ValfsX6，p.Glu746GlyfsX3，p.Ser393LysfsX2，p.Va1314PhefsX2)，一個通過外顯子跳躍導(dǎo)致提前出現(xiàn)終止密碼(p.Thr841X)的剪接位點突變(c．2663+1G>A)，2個包含整個RB1基因的缺失突變，缺失范圍分別約為3Mb和10Mb；另外，在RNA水平上檢測到一個RB1基因15、16和17外顯子缺失突變(p.Glu464_Ser565del)，但造成這一剪接異常的DNA水平上的突變

18、仍未確定。通過RB1基因檢測，為31個家庭提供了遺傳咨詢：并通過檢測絨毛、羊水或臍血DNA中的RB1基因突變，為12名孕婦進行了產(chǎn)前基因檢測，檢出1例攜帶RB1基因突變的胎兒。 綜上，本研究豐富了中國人的RB1基因突變譜。經(jīng)實踐證明，利用多種方法組合進行RB1基因突變篩查的策略靈敏有效，在19名遺傳性視網(wǎng)膜母細胞瘤患者中RB1基因突變檢出率達到100％，從而使RB1基因突變篩查有可能成為視網(wǎng)膜母細胞瘤患者的醫(yī)療方案的一個組成部分