先天性并指（趾）畸形和先天性厚甲癥家系致病基因鑒定及功能研究.pdf

1、本研究以五個先天性肢端畸形家系為研究對象（兩個Ⅰ-c型并指家系，一個Ⅳ型并指家系及兩個先天性厚甲癥家系），針對不同疾病家系進行致病基因定位、突變鑒定及功能分析等系列研究工作。其中，對于Ⅰ-c型并指畸形，OMIM數(shù)據(jù)庫中僅有表型的描述尚未進行致病基因定位及研究，而Ⅳ型并指及先天性厚甲癥已有相關(guān)致病基因報道，但存在突變篩查陰性患者，可能還存在新的致病變異形式或致病基因。對以上疾病開展研究，不僅能明確患者致病基因，致病突變及其功能影響，還能豐

2、富疾病表型譜和突變譜，為研究疾病表型-基因的關(guān)系以及致病機制提供理論依據(jù)，也對遺傳咨詢、基因診斷等臨床遺傳學服務具有重要運用價值。
　　本課題的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、Ⅰ-c型并指（趾）家系致病基因定位及功能研究
　　本部分研究家系A及家系B成員臨床特征表現(xiàn)為3-4指并指，不伴有多指及足部畸形，與OMIM數(shù)據(jù)庫中Ⅰ-c型描述表型相符，該型并指（趾）畸形疾病位點及致病基因均不明確?；诩蚁甸_展了基因定位、突變鑒

3、定及致病突變功能分析，旨在明確致病基因及致病突變，同時為并指/趾畸形機制的探索提供科學依據(jù)，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)致病基因定位:對五代74人家系A中28位成員（含17位患者）采用ABI連鎖分析試劑盒進行STR分型，共涉及30個STR遺傳標記覆蓋整條2號染色體;LINKAGE軟件包計算疾病位點與遺傳標記的LOD值發(fā)現(xiàn)D2S335標記處LOD值最大(4.88，θ=0)，證實了疾病位點與該標記緊密連鎖;選取D2S335附近多態(tài)性

4、高的遺傳標記構(gòu)建單體型進一步縮小致病區(qū)域，單體型分析結(jié)果提示D2S335，D2S2981，D2S2314和D2S324四個遺傳標記與疾病共分離;同時還排除了Ⅰ型SD已經(jīng)報道的3p21.31及2q34-q36區(qū)域:以上結(jié)果在家系B（三代11人家系含7名患者）中得到驗證，從而將Ⅰ-c型并指致病基因定位于2q31-32;
　　(2)致病基因及致病突變鑒定:區(qū)域候選基因測序發(fā)現(xiàn)家系A中所有患者攜帶有HOXD13基因c.917G＞A雜合突變

5、，該突變導致第306位密碼子由CGG突變?yōu)镃AG，氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝滨０?家系B所有患者攜帶HOXD13基因c.916C＞G雜合突變，該突變導致第306位密碼子CGG突變?yōu)镚GG，氨基酸由精氨酸突變?yōu)榱烁拾彼?，以上突變在健康對照及SNP數(shù)據(jù)庫中均未檢出。此外，對家系A中2位成員(正常及受累個體各1位）采用array-CGH排除了該區(qū)域可能存在的微缺失/重復變異。從而確定了Ⅰ-c型SD致病基因為HOXD13，以及家系致病突變c.91

6、7G＞A(p.R306Q)和c.916C＞G(p.R306G);
　　(3)致病突變功能初步研究:同源比對分析發(fā)現(xiàn)HOXD13基因第306位密碼子堿基及其編碼的氨基酸在物種間高度保守，PolyPhen-2及SIFTS分析提示家系致病突變“具有危害性”。構(gòu)建HOXD13野生型及306Q及306G突變型表達載體，同時構(gòu)建含有EPHA7啟動子的PGL3-basic報告基因載體PGL3-basic-EPHA7 promotor。雙熒光素酶

7、報告基因提示致病突變可降低HOXD13對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活能力，與野生型蛋白相比，306Q突變型降低38％，而306G突變型降低約40％，降低程度與已報道陽性對照1322L突變型蛋白相當（降低約42％）;
　　(4)HOXD13基因型-表型分析:HOXD13突變熱點為多聚Ala及同源結(jié)構(gòu)域homeodomain區(qū)。HOXD13突變引起的疾病表型異質(zhì)性強，可引起短指畸形，Ⅰ-c型SD，SPD1，Ⅴ型SD及短指-并趾綜合征等疾病，但表型

8、變異具有一定的連續(xù)性。從Ⅰ-c型SD表型（單側(cè)3-4指受累，雙側(cè)3-4指受累），過渡到SPD1型表型（雙側(cè)3-4指受累疊加3-4指蹼間多指骨，雙側(cè)3-4指并指多指，雙側(cè)3-4指并指多指疊加了4-5趾并趾，雙側(cè)3-4指并指多指疊加了4-5趾并多趾），最后過渡到疊加掌跖骨異常的Ⅴ型SD表型。此外，不同家系中或者家系不同成員間的表型存在重疊交叉現(xiàn)象。
　　本部分研究首次報道Ⅰ-c型并指致病基因為HOXD13。家系中發(fā)現(xiàn)的致病突變c.91

9、7G＞A(p.R306Q)及c.916C＞G(p.R306G)位于homeodomain區(qū)，突變可以影響HOXD13蛋白對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活能力。以上研究結(jié)果擴展了HOXD13基因的疾病譜、突變譜以及致病突變的功能認識，有助于進一步明確HOXD13基因及其所引起疾病的相互關(guān)系。
　　2、Ⅳ型并指畸形家系致病基因鑒定及功能研究
　　本部分研究家系為一個四人家系，有2位患者，其中一名臨床特征為六指畸形且全部并指，手指內(nèi)收彎曲形

10、似水杯，為典型的Ⅳ型SD表型(SD4)。其母為變異表型三節(jié)指節(jié)拇指-并指多指綜合征(Triphalangeal thumb-polysyndactylysyndrome，TPTPS)，SD4及TPTPS致病機制均為7q36的ZRS區(qū)域拷貝數(shù)增多。基于家系開展了致病突變鑒定及功能研究，旨在明確致病變異并為并指/趾畸形機制的探索提供科學依據(jù)，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)表型分析:家系同時存在SD4、TPTPS、軸前多趾、軸后多趾多種

11、表型，提示ZRS區(qū)拷貝數(shù)變異所引起的肢端畸形機制復雜;
　　(2)拷貝數(shù)變異分析:熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)患者ZRS區(qū)拷貝數(shù)目增加1.5倍，采用array-CGH證實變異染色體精確區(qū)域為Chr7:156，505，616-156，620，919，長度約115kb;
　　(3)ZRS區(qū)基因型-表型分析:ZRS區(qū)點突變，小片段插入以及拷貝數(shù)變異均會引起肢端畸形。其中點突變最常見，畸形程度輕，拷貝數(shù)變異罕見同時畸形程度最嚴重，輕微表型到嚴

12、重表型過渡具有一定的連續(xù)性，但是點突變位置，拷貝數(shù)變異長度與疾病輕重之間無明顯對應關(guān)系。
　　本部分研究證明了Ⅳ型SD與TPTPS致病機制具有遺傳同質(zhì)性，基因型-表型分析提示ZRS區(qū)輕微表型到嚴重表型的過渡具有一定的連續(xù)性。
　　3、先天性厚甲癥家系突變篩查及功能研究
　　本部分研究家系F01及F02臨床特征均為典型厚甲表型，F(xiàn)01同時伴有掌跖角化而F01伴有眼部及毛發(fā)異常，符合先天性厚甲癥表型報道。基于家系開展突變篩

13、查，致病突變功能研究及基因型-表現(xiàn)分析等系列研究工作，主要結(jié)果如下:
　　(1)突變篩查:家系F01中所有患者及胎兒均攜帶有KRT16基因c.383T＞C雜合突變，導致128位密碼子CTG突變?yōu)镃CG，編碼氨基酸由亮氨酸突變?yōu)楦彼?p.Leu128Pro)，該突變在健康對照及SNP數(shù)據(jù)庫中均未檢出。家系F02未檢測到厚甲基因的致病突變;
　　(2)致病突變功能預測:同源比對分析提示KRT16基因第128位密碼子及其編碼的氨

14、基酸在物種間高度保守，PolyPhen-2及SIFTS預測突變蛋白p.Leu128Pro具有危害性;
　　(3)突變蛋白二級結(jié)構(gòu)預測:采用Swiss-Model對野生型及突變型蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預測分析，結(jié)果提示當128Leu突變?yōu)镻ro后，正常的α螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)轭愃祁i環(huán)樣結(jié)構(gòu)的異常螺旋結(jié)構(gòu)，進而影響蛋白高級結(jié)構(gòu)的組裝;
　　(4)突變蛋白細胞形態(tài)學研究:構(gòu)建KRT16-128Leu及KRT16-128Pro與綠色熒光蛋白EGF

15、P融合表達載體，轉(zhuǎn)染293FT細胞發(fā)現(xiàn)野生型融合蛋白熒光信號強且均勻，細胞形態(tài)為正常的梭形，而突變型融合蛋白熒光信號弱且彌散，細胞形態(tài)異常表現(xiàn)為多邊形及圓形;
　　(5)KRT16基因型-表型分析:KRT16基因高頻突變位點為第125，127和132位密碼子，約63％報道的PC-16型患者均屬這三個位置的突變。部分突變氨基酸類別、位點與疾病的輕重程度有密切關(guān)系，第127和128位密碼子突變?yōu)楦彼釙r患者伴有嚴重的掌跖角化現(xiàn)象。

16、r>　　本部分研究在中國患者中鑒定了新突變c.383T＞C(p.Leu128Pro)，該突變可導致蛋白二級結(jié)構(gòu)異常，影響到蛋白高級組裝，進而影響到細胞正常形態(tài)。此外，先天性厚甲仍然存在篩查陰性的患者，該現(xiàn)象也進一步提示PC可能存在新的致病變異形式或致病基因。
　　綜上所述，本課題對Ⅰ-c型并指，Ⅳ型并指及先天性厚甲癥三種肢端畸形家系開展研究。首次明確了Ⅰ-c型并指畸形致病基因為HOXD13，在三種疾病中均報道了致病基因的新突變，并