一種新的肝癌標(biāo)記分子的鑒定及其相關(guān)功能的初步研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)位居腫瘤致死率的第二位，死亡率為20.37/105[1]。目前治療原發(fā)性肝癌的方法很多，包括手術(shù)治療、放療、化療和生物治療。其中以手術(shù)切除治療為最有效的治療方法。但是，很多病人在診斷為肝癌的時(shí)候已經(jīng)發(fā)生了肝內(nèi)或肝外的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而錯(cuò)過(guò)了手術(shù)的最好時(shí)機(jī)。因此，早期診斷原發(fā)性肝癌對(duì)患者來(lái)說(shuō)至觀重要。原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)記分子以其方便、廉價(jià)、令人滿意的準(zhǔn)確性被普遍用于惡性腫瘤的篩選。原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)記分子可

2、分為四大類(lèi)：①癌胚抗原和糖蛋白抗原；②酶和同工酶；③細(xì)胞因子；④相關(guān)基因。 雖然上述各種原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)記分子在肝癌的診斷中發(fā)揮著重要的作用，但是由于它們各自的局限性，都不能單獨(dú)作為診斷指標(biāo)去檢測(cè)原發(fā)性肝癌的存在，而必須通過(guò)與其他分子的聯(lián)合應(yīng)用。為了尋找新的、更為特異的原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)記分子，我們實(shí)驗(yàn)室早期嘗試通過(guò)雙向電泳和基因芯片的方法對(duì)原發(fā)性肝癌組織與非腫瘤的肝臟組織相比較，除了找到一些已知的肝癌腫瘤標(biāo)記分子外（如AFP

3、,VEGF,AFU 等），又發(fā)現(xiàn)了6 個(gè)未報(bào)道的與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的分子，其中LIN28B 基因變化最為明顯。 研究目的:本研究旨在探討LIN-28B基因在肝癌組織及其癌旁組織，以及其他病因的肝臟正常組織中的表達(dá)差異，以便評(píng)價(jià)該基因作為原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)記分子的可行性；進(jìn)而通過(guò)過(guò)表達(dá)和RNA 干涉技術(shù)對(duì)LIN-28B 基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮的功能進(jìn)行初步的研究，為將來(lái)肝癌細(xì)胞的治療提供新的靶點(diǎn)。 研究方法:首

4、先構(gòu)建LIN-28B的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化融合蛋白后，常規(guī)免疫家兔，制備針對(duì)LIN-28B蛋白的兔抗人多克隆抗體；接著，運(yùn)用Real-time PCR的方法檢測(cè)肝癌組織及癌旁組織和正常組織中LIN-28B在mRNA水平的表達(dá)情況，同時(shí)應(yīng)用制備的兔抗人LIN-28B多克隆抗體檢測(cè)LIN-28B在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況；最后，構(gòu)建LIN-28B基因的真核表達(dá)載體和干涉載體，分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入MCF-7和HepG2細(xì)胞中，通過(guò)MTT和流式細(xì)

5、胞儀分析，觀察過(guò)表達(dá)或封閉LIN-28B基因后對(duì)細(xì)胞增殖及周期的影響。 研究結(jié)果:成功構(gòu)建了LIN-28B 的原核表達(dá)載體，制備并獲得了效價(jià)為1：64000 的特異性兔抗人LIN-28B多克隆抗體。Real-time PCR分析顯示，低分化的肝癌組織中LIN-28B的陽(yáng)性率為100％；中等分化的肝癌組織中該基因的陽(yáng)性率為71.4％；高分化的肝癌組織中LIN-28B的陽(yáng)性率只有20％。癌旁組織和正常肝組織中該基因低表達(dá)或不表達(dá)。

6、Western Blot檢測(cè)的該基因蛋白質(zhì)表達(dá)情況與mRNA的結(jié)果相似。將外源性LIN-28B基因穩(wěn)轉(zhuǎn)入MCF-7細(xì)胞系（無(wú)LIN-28B 基因表達(dá)）后可明顯促進(jìn)該細(xì)胞的增殖，而通過(guò)封閉HepG2細(xì)胞的內(nèi)源性LIN-28B基因，則可顯著降低該細(xì)胞的增殖，并伴有細(xì)胞G1期的阻滯。 結(jié)論:本研究顯示：一方面LIN-28B蛋白的表達(dá)隨著肝癌惡性程度的增加而逐漸升高，提示該分子有可能作為一種新型的原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)記分子，用于對(duì)原發(fā)性