一種新的腫瘤相關(guān)抗原MGb2-Ag-TRAK1的鑒定和功能研究.pdf_第1頁(yè)
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1、【背景】
  MGb2是本研究所建立的一種胃腸道腫瘤特異性單克隆抗體。利用該抗體檢測(cè)胃癌敏感性高、特異性強(qiáng),對(duì)胃印戒細(xì)胞癌尤為明顯。但是,該抗體建立20年來(lái),其識(shí)別抗原MGb2-Ag一直沒(méi)有鑒定成功,故對(duì)其的認(rèn)識(shí)非常有限。
  【目的】
  進(jìn)一步觀察MGb2-Ag在人體多種組織中的表達(dá)分布特征,明確其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的臨床病理診斷價(jià)值,鑒定MGb2-Ag,并研究其在腫瘤細(xì)胞中可能的作用。
  【方法】
 

2、?。?)用免疫組化方法檢測(cè)人體多種組織中MGb2-Ag的表達(dá)分布特征。
  (2)以141例胃癌(n=81)和非胃癌患者(n=60)的胃組織石蠟切片標(biāo)本作為研究對(duì)象,用免疫組化方法評(píng)價(jià)MGb2-Ag在胃癌發(fā)生發(fā)展中的臨床病理診斷價(jià)值。免疫組化染色結(jié)果判斷結(jié)合染色細(xì)胞數(shù)量和染色程度進(jìn)行綜合評(píng)分分析。
 ?。?)用Westernblotting檢測(cè)7種胃癌細(xì)胞系和1種胃黏膜上皮細(xì)胞永生化細(xì)胞系GES-1中MGb2-Ag的表達(dá),并

3、初步確定目的蛋白的分子量。
  (4)以胃癌細(xì)胞系和新鮮胃癌組織為材料,用免疫沉淀技術(shù)(IP)富集MGb2-Ag,SDS-PAGE膠分離目的抗原后切膠進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)分析,獲得候選分子為TRAK1(Traffickingprotein,kinesin-binding1)。
 ?。?)以下列方法進(jìn)一步鑒定MALDI-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果:用抗TRAK1抗體和MGb2抗體檢測(cè)原核表達(dá)的TRAK1蛋白,用兩

4、種抗體分別檢測(cè)組織連續(xù)切片中TRAK1和MGb2-Ag蛋白的組織表達(dá)特征和亞細(xì)胞定位特征。
  (6)借助RNAi(RNAinterference)技術(shù),設(shè)計(jì)Trak1siRNAs,構(gòu)建其表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系MKN-45,篩選有效靶序列,觀察轉(zhuǎn)染Trak1siRNAs對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。
  【結(jié)果】
 ?。?)MGb2-Ag在人體多種組織中的表達(dá)特征:組織和器官不同,MGb2-Ag表達(dá)水平不同;

5、在人癌組織,特別是胃癌中高表達(dá);在處于癌前狀態(tài)的組織中(胃、結(jié)腸和膽囊等)弱表達(dá);正常組織中幾乎不表達(dá);在正常胰腺的胰島和腦灰質(zhì)神經(jīng)元中,能夠觀察到特異性的表達(dá)。
 ?。?)胃癌組織分化越差(P=0.015),腫瘤細(xì)胞侵襲深度越深(P<0.001),腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生越多(P=0.011),MGb2-Ag表達(dá)水平越高。隨機(jī)挑選胃癌患者癌旁組織標(biāo)本(n=16)檢測(cè)MGb2-Ag,發(fā)現(xiàn)其在癌組織中的表達(dá)高于相應(yīng)癌旁組織(P=0.

6、001)。同時(shí),本研究觀察到慢性淺表性胃炎組織中MGb2-Ag的表達(dá)低于其在癌前狀態(tài)組織(本研究包括萎縮性胃炎、腸上皮化生、胃息肉)中的表達(dá)(P=0.005)。MGb2-Ag在胃癌中陽(yáng)性率為81.48%(66/81),其中,在胃印戒細(xì)胞癌和粘液細(xì)胞癌的中陽(yáng)性率為100%(23/23);MGb2-Ag在癌前狀態(tài)組織中陽(yáng)性率為13.16%(5/38),在慢性淺表性胃炎組織中陽(yáng)性率為0%(0/22);胃癌組織中MGb2-Ag的陽(yáng)性率高于所有非

7、癌組織(P<0.001)。
  (3)MGb2-Ag在7種胃癌細(xì)胞系中呈不同程度的表達(dá),但在人永生化胃黏膜細(xì)胞系GES-1中的表達(dá)很弱。該抗原用Westernblotting可檢測(cè)到2條蛋白質(zhì)條帶,分子量分別為~115kDa和~100kDa,所有細(xì)胞樣品皆有的條帶是~100kDa。明顯呈兩條條帶的細(xì)胞是MKN-45、SGC-7901和AGS細(xì)胞。
 ?。?)切取從MKN-45細(xì)胞、KATOIII細(xì)胞和胃癌組織中富集到的目的抗

8、原MGb2-Ag條帶(~100kDa),MALDI-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果均顯示候選分子均為TRAK1。原核表達(dá)的TRAK1蛋白能夠被MGb2單抗和羊TRAK1多抗所識(shí)別。用MGb2單抗和羊TRAK1多抗檢測(cè)胃癌、腸上皮化生、慢性淺表性胃炎等組織的連續(xù)切片,發(fā)現(xiàn)染色定位、細(xì)胞類型等特征高度一致。
 ?。?)成功構(gòu)建Trak1siRNA表達(dá)載體,篩選出2對(duì)針對(duì)Trak1的siRNA,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MKN-45細(xì)胞,與對(duì)照siRNA比較,兩者均

9、顯著減少細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期進(jìn)展。
  【結(jié)論】
  本研究進(jìn)一步觀察了MGb2-Ag在人體多種組織的分布特征;發(fā)現(xiàn)MGb2-Ag是胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中一種有意義的病理診斷標(biāo)志物,MGb2-Ag表達(dá)增加可能是胃癌發(fā)生的早期事件;成功鑒定MGb2-Ag為一種新分子TRAK1,首次發(fā)現(xiàn)TRAK1是一種新的胃癌診斷標(biāo)志物;本研究還借助RNAi介導(dǎo)的TRAK1低表達(dá)效應(yīng),首次研究了TRAK1在腫瘤細(xì)胞中的功能,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染

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