自噬相關(guān)線粒體蛋白mitofilin的鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、目的：
　　 1、建立饑餓誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞自噬模型以及相應(yīng)的檢測(cè)指標(biāo)體系,并以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選自噬后發(fā)生表達(dá)變化的線粒體蛋白質(zhì)。
　　 2、對(duì)篩選出的其中一個(gè)差異線粒體蛋白質(zhì)mitofilin進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證,以確認(rèn)其在自噬前后的差異表達(dá)。
　　 3、探索mitofilin與自噬的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1、HeLa細(xì)胞傳代培養(yǎng),采用饑餓法(以HBSS代替培養(yǎng)基)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生自噬。<

2、br>　　 2、HeLa細(xì)胞自噬檢測(cè):透射電鏡檢測(cè)自噬體的雙層或多層膜結(jié)構(gòu)形成；Westernblot檢測(cè)正常HeLa細(xì)胞與自噬細(xì)胞的自噬體標(biāo)記蛋白LC3。
　　 3、HeLa細(xì)胞傳代培養(yǎng),至細(xì)胞總量達(dá)到約1×108個(gè)左右時(shí),采用饑餓法(以HBSS代替培養(yǎng)基)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生自噬,用試劑盒提取正常組與自噬組HeLa細(xì)胞線粒體蛋白。
　　 4、采用雙向電泳(pH3-10)建立自噬狀態(tài)下與正常狀態(tài)下的線粒體差異蛋白質(zhì)圖

3、譜。
　　 5、利用PDQuest對(duì)雙向圖譜進(jìn)行分析,篩選出差異蛋白。
　　 6、采用LC/MS/MS質(zhì)譜鑒定上述篩選到的差異蛋白并以Mascot等蛋白質(zhì)搜索引擎檢索Swissprot、NCBInr等數(shù)據(jù)庫(kù),獲得蛋白質(zhì)信息。
　　 7、Western blot與Real-time PCR驗(yàn)證差異蛋白之一mitofilin在自噬前后的差異表達(dá)。
　　 8、克隆mitofilin基因,將其插入pcDNA3.1

4、(+)-HA質(zhì)粒構(gòu)建真核表達(dá)載體,并合成其siRNA片段。
　　 9、構(gòu)建將自噬體特異標(biāo)記蛋白LC3基因克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,建立GFP-LC3/HeLa穩(wěn)定細(xì)胞株,以便于對(duì)自噬相關(guān)蛋白的功能進(jìn)行研究。
　　 10、采用RNAi和過(guò)表達(dá)技術(shù),結(jié)合饑餓誘導(dǎo)模型與自噬檢測(cè)體系,檢測(cè)mitofilin高表達(dá)/表達(dá)受阻的情況下是否誘導(dǎo)/抑制細(xì)胞自噬,從而研究其在自噬發(fā)生過(guò)程中的作用。
　　

5、 結(jié)果：
　　 1、建立饑餓法誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生自噬的模型及其檢測(cè)體系,并摸索確定了線粒體提純方法。
　　 2、篩選得到了自噬狀態(tài)下與正常狀態(tài)下的部分差異線粒體蛋白質(zhì)。
　　 3、Western blot與Real-time PCR驗(yàn)證mitofilin在細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)在mRNA水平與蛋白水平均下調(diào)。
　　 4、建立了穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的HeLa細(xì)胞株,為自噬相關(guān)蛋白質(zhì)的功能研究提供了有利的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>