大麥自噬同源基因ATG6的鑒定和功能研究.pdf

1、自噬是真核生物細(xì)胞中一種進(jìn)化保守的生理過(guò)程，在這過(guò)程中，自噬相關(guān)基因ATG6編碼的蛋白可以形成磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)復(fù)合體Ⅰ，以此調(diào)控自噬過(guò)程的發(fā)生和自噬小體的形成。擬南芥、煙草、水稻和小麥中的功能研究表明，ATG6同源蛋白及其具有的自噬功能與植物體抗脅迫和病原菌侵染引起的免疫反應(yīng)密切相關(guān)，此外，擬南芥AtATG6基因的突變還會(huì)導(dǎo)致花粉不能萌發(fā)。因此，ATG6蛋白的功能研究不但能促進(jìn)對(duì)植物自噬分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，而且可以應(yīng)用于調(diào)控植

2、物生長(zhǎng)發(fā)育及改良抗脅迫性能。
　　本研究以大麥為材料，在其基因組中搜索自噬相關(guān)的同源ATG6功能蛋白(HvATG6)，通過(guò)基因克隆，序列結(jié)構(gòu)分析，亞細(xì)胞定位，酵母功能互補(bǔ)，表達(dá)譜分析和基因瞬時(shí)沉默試驗(yàn)，初步證明該蛋白具自噬相關(guān)的功能，且與大麥抗脅迫之間具有關(guān)聯(lián)性。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1 大麥ATG6蛋白的篩選和序列分析
　　以擬南芥和水稻的ATG6蛋白序列為參照，在大麥數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索，篩選得到大麥中的ATG

3、6同源蛋白，命名為HvATG6(Ensemble plants數(shù)據(jù)庫(kù)中基因編號(hào)為MLOC_71271)。通過(guò)序列比對(duì)、功能結(jié)構(gòu)域搜索和進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)HvATG6與其他植物特別是小麥，水稻的ATG6同源蛋白序列相似度分別達(dá)到了90％和70％以上，HvATG6蛋白中也含有相應(yīng)的β-折疊-α-螺旋自噬功能結(jié)構(gòu)域，暗示著該蛋白可發(fā)揮自噬功能。
　　2 HvATG6蛋白的細(xì)胞學(xué)定位和功能分析
　　2.1 HvATG6蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)

4、中
　　在大麥原生質(zhì)體中轉(zhuǎn)化并表達(dá)N端GFP融合的HvATG6蛋白，發(fā)現(xiàn)HvATG6蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，并且能形成類(lèi)似于自噬小體前體(Pre-autophagosomalstructure，PAS)的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明其可能在大麥細(xì)胞中發(fā)揮自噬功能。2.2 HvATG6能夠互補(bǔ)酵母atg6突變體中的自噬功能缺陷
　　將HvATG6蛋白在酵母atg6突變體細(xì)胞中表達(dá)，在氮源營(yíng)養(yǎng)缺陷條件下處理后，發(fā)現(xiàn)該酵母突變體可以重新出現(xiàn)類(lèi)似自噬

5、小體的結(jié)構(gòu)，說(shuō)明HvATG6蛋白可以彌補(bǔ)酵母細(xì)胞因其ATG6基因突變引起的自噬缺陷，亦即HvATG6同源蛋白在酵母細(xì)胞中仍可以發(fā)揮其相應(yīng)的自噬功能。
　　3 HvATG6基因在多種非生物脅迫條件下表達(dá)上調(diào)
　　野生型大麥在高鹽、干旱、冷、氮源缺陷和鋁處理等多種非生物脅迫條件下，幼苗中HvATG6基因表達(dá)水平與對(duì)照相比明顯上調(diào)。其中，在鋁毒脅迫下HvATG6基因的表達(dá)變化最為顯著，鋁敏感品種GP(Golden Promise)

6、幼苗分別在10μM或30μM Al3+處理72 h的結(jié)果表明，根中HvA TG6的基因表達(dá)水平均為正常培養(yǎng)幼苗根中的4倍以上，10μM Al3+脅迫處理4h后還發(fā)現(xiàn)，HvATG6基因只在根尖處有比較明顯的上調(diào)表達(dá)，而這種變化在不同鋁敏感大麥品種之間有著明顯的差異。這些均表明HvATG6基因的表達(dá)與大麥脅迫反應(yīng)密切相關(guān)，同時(shí)也符合自噬過(guò)程能幫助植物抵抗外界脅迫環(huán)境的功能特征。
　　4 HvATG6基因瞬時(shí)沉默的大麥株系對(duì)脅迫環(huán)境的敏

7、感性增強(qiáng)
　　通過(guò)大麥條紋花葉病毒(Barley strip mosaic virus，BSMV)介導(dǎo)的葉片基因沉默實(shí)驗(yàn)，得到了在大麥新生葉片中ATG6基因表達(dá)水平明顯下降的植株。接著在黑暗條件或者氧化脅迫中分別處理后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，ATG6基因表達(dá)下調(diào)的植株離體葉片出現(xiàn)更強(qiáng)程度的黃化或者衰老現(xiàn)象，這表明HvATG6基因的沉默削弱了大麥葉片的抗脅迫能力，進(jìn)而使其對(duì)脅迫環(huán)境的敏感性增強(qiáng)，這亦符合植物自噬基因缺陷后的功能特征。