HMGA2調(diào)節(jié)Atg12-Atg5的形成在鉻誘導自噬中的機制研究.pdf

1、鉻(Cr)，作為一種銀灰色金屬，在自然界中存在二價、三價和六價三種價態(tài)。六價鉻毒性最大，國際癌癥研究機構(gòu)1990年就將六價鉻列為確認的I類致癌物。大量流行病學研究和動物實驗研究表明，暴露在環(huán)境中的六價鉻化合物與多種癌癥和腫瘤的發(fā)病密切相關。研究表明，低劑量的六價鉻可以誘導自噬，其機制是通過吞噬腫瘤細胞受損的細胞器和細胞質(zhì)蛋白，并將其降解成細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)再循環(huán)利用，維持腫瘤細胞活性，提高腫瘤細胞增殖率，促進腫瘤的發(fā)生。自噬可以誘發(fā)腫瘤

2、，并為其提供一個低氧氣和營養(yǎng)限制的條件，此過程需要自噬相關蛋白（ATG）協(xié)調(diào)參與。HMGA2在不同的生物學過程中具有關鍵意義。HMGA2在許多惡性腫瘤中過表達。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)氯化鎘（CdCl2）通過誘導 ROS的形成引起了HMGA2表達上調(diào)，而HMGA2表達上調(diào)導致了MRC-5細胞周期和細胞增殖的變化。我們也發(fā)現(xiàn)了，氯化鎘引起細胞增殖的濃度同樣誘導了細胞發(fā)生自噬。現(xiàn)階段沒有文獻報道 HMGA2在自噬中的作用，且低劑量重鉻酸鉀誘導自噬

3、的機制也在探索階段。因此，本研究以重鉻酸鉀作為研究對象，探討HMGA2在重鉻酸鉀所引起的自噬中的作用。
　　目的：研究低濃度的重鉻酸鉀對自噬的影響，及 HMGA2在重鉻酸鉀誘導自噬中的可能分子機制。
　　方法：本研究以人肺腺癌細胞（A549細胞）和人胚腎細胞（HEK293細胞）作為體外實驗模型，以BALB/c小鼠作為體內(nèi)實驗模型。BALB/c小鼠經(jīng)重鉻酸鉀處理后，利用蛋白質(zhì)印跡法觀察小鼠肺組織自噬相關蛋白、HMGA1和 HM

4、GA2蛋白的表達情況。利用透射電子顯微鏡檢測重鉻酸鉀對小鼠肺組織自噬小體數(shù)量的影響。利用MTT法檢測重鉻酸鉀對A549細胞的細胞增殖率的影響，及自噬干預劑3-MA預處理后染毒重鉻酸鉀的A549細胞的細胞增殖率的變化。利用吖啶橙染色和透射電子顯微鏡觀察重鉻酸鉀對 A549細胞自噬溶酶體和自噬小體數(shù)量的影響，利用蛋白質(zhì)印跡法觀察自噬相關蛋白表達的變化。運用siRNA干擾技術，檢測 HMGA2對重鉻酸鉀所引起的細胞自噬的影響。利用吖啶橙染色和

5、透射電子顯微鏡觀察HMGA2對重鉻酸鉀處理的A549細胞內(nèi)自噬溶酶體和自噬小體數(shù)量的影響，利用蛋白質(zhì)印跡法觀察HMGA2對自噬相關蛋白表達量的影響，qPCR實驗觀察 HMGA2對 Atg5和 Atg12基因的表達情況的影響。在 HEK293細胞轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-HMGA2質(zhì)粒，通過蛋白質(zhì)印跡法觀察HMGA2對自噬相關蛋白表達量的影響。
　　結(jié)果：重鉻酸鉀處理的BALB/c小鼠肺組織自噬相關蛋白（LC3II、p62、Atg12-

6、Atg5、Atg4、Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1）、HMGA1和HMGA2蛋白的表達量均升高（P＜0.05，P＜0.01）。透射電子顯微鏡觀察的結(jié)果也顯示染毒組小鼠肺組織自噬小體數(shù)量增加（P<0.01），說明重鉻酸鉀誘導BALB/c小鼠肺組織自噬。低濃度重鉻酸鉀（0.1、0.2μM）作用A549細胞24小時后，吖啶橙染色和透射電子顯微鏡結(jié)果可見細胞內(nèi)自噬溶酶體和自噬小體數(shù)量的顯著增加（P<0.01），自噬相關蛋白（LC

7、3II、Atg12-Atg5、Atg4）、HMGA1和HMGA2的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），p62蛋白表達水平下降。說明低濃度重鉻酸鉀誘導A549細胞自噬。在HMGA2 siRNA處理的A549細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，自噬溶酶體和自噬小體的數(shù)量減少、LC3II和Atg12-Atg5蛋白表達水平降低，p62蛋白降解抑制，但Atg5和Atg12蛋白水平無明顯變化。說明HMGA2可能是通過Atg12-Atg5偶聯(lián)蛋白調(diào)控重鉻酸鉀

8、誘導的細胞自噬。為了證明我們的觀點，利用qPCR實驗，分析證實Atg5和Atg12基因的表達量并不隨著HMGA2的變化而改變。在HEK293細胞中，可以檢測到隨著HMGA2表達量的升高，LC3II和Atg12-Atg5蛋白表達水平升高，p62表達水平下降，Atg5和 Atg12蛋白的表達水平無明顯差異。上述結(jié)果表明，HMGA2是通過調(diào)節(jié)Atg12-Atg5偶聯(lián)結(jié)合從而促進重鉻酸鉀誘導的細胞自噬。
　　結(jié)論：HMGA2誘導Atg12