自噬相關(guān)基因Atg7敲除對三鄰甲苯磷酸酯誘導(dǎo)的Neuro-2a細胞軸突損傷的影響.pdf

1、目的：
　　三鄰甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP)是工業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的有機磷化合物。人類暴露TOCP可導(dǎo)致一種遲發(fā)性神經(jīng)病（organophosphate-induced delayed neuropathy，OPIDN）的發(fā)生，到目前為止其確切發(fā)生機制尚不清楚。以前的研究顯示OPIDN中神經(jīng)軸突的病理變化與物理截斷引起的軸突wallerian變性相似，即神經(jīng)軸突自末端向胞體進行性地變性

2、、解體。自噬是真核細胞中負責(zé)蛋白質(zhì)和細胞器清除的主要機制，對于神經(jīng)元維持自身穩(wěn)態(tài)具有重要作用。眾多研究證明神經(jīng)元自噬異常和軸突變性有關(guān)。在本研究中，我們利用自噬相關(guān)基因Atg7敲除的自噬缺陷N2a細胞建立中毒模型，研究自噬在TOCP誘導(dǎo)的Neuro-2a(N2a)軸突損傷中的作用，探索TOCP誘導(dǎo)遲發(fā)性神經(jīng)病的發(fā)生機制。
　　方法：
　　1.細胞毒性實驗:CCK8方法測試不同濃度TOCP對N2a細胞增殖的影響，確定OPIDN

3、細胞模型中TOCP染毒劑量。
　　2.細胞分化實驗:培養(yǎng)野生型和Atg7基因敲除的自噬缺陷型N2a細胞，分別使用低血清和視黃酸(Retinoic acid, RA)兩種方法誘導(dǎo)野生型N2a細胞(Atg7+/+N2a)和自噬缺陷N2a細胞(Atg7-/-N2a)，分化24h、48h，直至呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元形態(tài)。
　　3.細胞分化能力和軸突損傷情況檢測實驗:利用0、1.25、2.5、5、10、20μMTOCP處理Atg7+/+N2

4、a細胞，觀察毒物對細胞分化能力的影響。在此基礎(chǔ)上，以0、5、10μM濃度的TOCP染毒低血清和視黃酸兩種方法誘導(dǎo)分化的Atg7+/+N2a細胞和Atg7-/-N2a細胞，觀察比較兩種N2a細胞軸突變化情況。
　　4.細胞免疫熒光實驗:使用免疫熒光法檢測0、5、10μM TOCP處理后的Atg7+/+N2a細胞和Atg7-/-N2a細胞中軸突轉(zhuǎn)運蛋白dynaction和自噬標(biāo)志蛋白LC3B的變化水平。
　　5.蛋白免疫印跡實驗

5、:Western blotting檢測Atg7+/+N2a細胞和Atg7-/-N2a細胞中LC3、p62、p-p62、beclin-1、Ub、k48-Ub、k63-Ub等自噬相關(guān)蛋白，kinesin、dynactin等軸漿運輸馬達蛋白，以及促進軸突損傷相關(guān)蛋白SARM1的表達和MAPK信號通路關(guān)鍵分子的磷酸化水平的變化。
　　6.實時熒光PCR(Quantitative Real-time PCR，Q-PCR)實驗:使用Q-PCR

6、檢測細胞自噬相關(guān)基因LC3B、beclin1和轉(zhuǎn)錄因子EB的mRNA表達情況，以及軸突變性相關(guān)的關(guān)鍵分子calpain-1、calpain-2、nmnat-2、sarm1、DLK和scg10等基因的mRNA表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.CCK8法檢測結(jié)果顯示，TOCP染毒劑量超過20μM后，隨著劑量的增加，對細胞增殖抑制作用越來越明顯，直至超過1000μM后細胞活性為零。
　　2.低血清和RA兩種方法誘導(dǎo)48h之后均

7、可使兩種N2a細胞分化成功，即突起長度超過胞體兩倍。其中，RA誘導(dǎo)分化的細胞軸突分化長度更明顯。
　　3.①Atg7+/+N2a細胞染毒TOCP之后，明顯影響了其分化能力，且隨著劑量的增加，抑制分化能力越明顯。②使用TOCP染毒后，兩種細胞軸突長度明顯縮短，且隨著TOCP染毒劑量增加，軸突損傷逐漸加重。同一劑量下，Atg7-/-N2a細胞軸突縮短程度相較于野生型的小。
　　4.免疫熒光結(jié)果顯示，隨著TOCP染毒劑量的增加，兩

8、種細胞中軸突微管馬達蛋白Dynactin表達下降，標(biāo)記自噬泡綠色熒光亮點增多。兩種細胞間無顯著性差異。
　　5.Western blotting實驗結(jié)果顯示:Atg7+/+N2a細胞中beclin-1含量減少，LC3-Ⅱ含量明顯增加，Atg7-/-N2a細胞中beclin-1同樣呈現(xiàn)下降趨勢，LC3-Ⅱ不表達。兩種細胞中p-p62水平上調(diào)，Atg7-/-N2a細胞中p-p62表達量更高。高劑量組兩種細胞中軸突運輸馬達蛋白dynac

9、tin和kinesin表達均減少。兩種細胞中K48-位點泛素蛋白水平增加，Atg7-/-N2a細胞表達量更高。Atg7+/+N2a細胞中對軸突損傷具有促進性作用的激酶p-p38、p-p42/p44磷酸化水平上升，p-jnk表達下調(diào)，蛋白SARM1表達增加，而Atg7-/-N2a細胞中除激酶p-p38呈現(xiàn)上升趨勢外，其余均無顯著性差異，p-p42/p44在兩種細胞間變化具有統(tǒng)計學(xué)差異，Atg7+/+N2a細胞磷酸化水平更高。
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10、.熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn):自噬相關(guān)基因LC3B、beclin1、轉(zhuǎn)錄因子EB的mRNA水平在兩種細胞中隨著藥物劑量的增加而逐步上升。calpain-1在高劑量染毒的Atg7+/+N2a細胞中激活，而在Atg7-/-N2a細胞中calpain-1、 calpain-2均被激活。對軸突損傷起保護作用nmnat2基因表達情況是:Atg7+/+N2a細胞逐步上升，而Atg7-/-N2a細胞呈下降趨勢，0、5μMTOCP處理組中Atg7-/-N2

11、a細胞表達量更高。同軸突損傷相關(guān)的sarm1在高劑量染毒的兩種細胞中顯著性增加。高劑量組Atg7+/+N2a細胞中DLK含量上升，而Atg7-/-N2a細胞卻呈現(xiàn)相反趨勢。
　　結(jié)論：
　　1.TOCP染毒影響了Atg7+/+N2a和Atg7-/-N2a細胞的分化能力，并能引起已分化的N2a細胞的軸突損傷，其中Atg7+/+N2a細胞的損傷程度比Atg7-/-N2a細胞更加嚴(yán)重。
　　2.TOCP染毒引起N2a細胞自噬