TRX基因在Neuro-2A細(xì)胞中的表達(dá)及其對氧自由基清除作用的研究.pdf

1、目的:硫氧還蛋白(Thioredoxin，TRX)是廣泛存在于真核生物神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的一種具有抗氧化應(yīng)激功能的小分子蛋白。當(dāng)細(xì)胞受到氧化損傷時(shí)，能在一定程度上清除氧自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受諸如腫瘤壞死因子和氫過氧化物的的損害。TRX對于機(jī)體神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用已經(jīng)被證實(shí)，并且已逐漸引起人們對其具體保護(hù)效果的關(guān)注。一些研究顯示，應(yīng)用TRX處理后可使培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞存活率大幅度提高。雖然細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示TRX具有抗氧化功能，但對于TRX的具體保護(hù)效

2、果的研究資料有限，以至迄今尚未把TRX作為一種外源性的治療藥物或治療手段來研究并做出明確的結(jié)論。
　　 基因治療是近年來分子生物學(xué)領(lǐng)域逐漸興起的一種新的疾病治療方法，可以將某種特定基因?qū)塍w細(xì)胞表達(dá)以產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)因子，實(shí)現(xiàn)對疾病的治療作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，我們把正常的人類TRX基因?qū)胨芯康漠惙N生物細(xì)胞內(nèi)，以觀察TRX基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效果和保護(hù)作用，目的是研究TRX通過基因治療途徑來發(fā)揮其防治效果的可行性，并初步探討T

3、RX發(fā)揮抗氧化作用的可能機(jī)制。
　　 由于機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含有大量的不飽和脂肪酸，故更易受到自由基的攻擊，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化等損傷，因此本研究選用小鼠神經(jīng)嵴母細(xì)胞瘤(Neuro-2A)作為實(shí)驗(yàn)對象。Neuro-2A細(xì)胞是一種具有正常神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和生理生化特性的神經(jīng)元腫瘤細(xì)胞，保留了一系列正常神經(jīng)細(xì)胞的功能，對于神經(jīng)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究具有較廣泛的代表性。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在探討TRX轉(zhuǎn)染Neuro-2A細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相應(yīng)蛋

4、白因子，對細(xì)胞的具體保護(hù)效果，進(jìn)一步補(bǔ)充TRX對神經(jīng)系統(tǒng)具體保護(hù)效果的研究資料，進(jìn)而為基因治療的基礎(chǔ)研究提供初步的方法學(xué)依據(jù)，也為臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生物學(xué)治療方法探索一條新的途徑。
　　 方法:以Neuro-2A細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，將質(zhì)粒PIRES2-EGFP-TRX轉(zhuǎn)染Neuro-2A細(xì)胞，挑出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，使其形成一個(gè)細(xì)胞株，并通過RT-PCR法檢測細(xì)胞中TRX的mRNA的表達(dá)水平。將H2

5、O2作用于Neuro-2A細(xì)胞，建立氧化損傷模型，觀察轉(zhuǎn)染組及非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的外觀形態(tài)和存活率。以四唑鹽(MTT)法檢測兩組細(xì)胞的存活率，以苯二醛(OPT)測定兩組細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)水平，采用單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞的DNA鏈斷裂情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSSv11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:一、轉(zhuǎn)染后的Neuro-2A細(xì)胞于倒置熒光顯微鏡下觀察，可見轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光。應(yīng)用RT

6、-PCR法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中TRX的mRNA的表達(dá)水平，于分子量約318bp處可見清晰條帶，而非轉(zhuǎn)染細(xì)胞則未見條帶。二、MTT法檢測細(xì)胞存活率:用0.0625mM-2.0mM的H2O2作用于兩組細(xì)胞3h后，兩組細(xì)胞的存活率呈逐漸降低趨勢;但在各損傷濃度中，轉(zhuǎn)染組比非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率增高（P＜0.05或P＜0.01）。三、細(xì)胞內(nèi)GSH水平測定:用0.03125mM-0.5mM的H2O2作用于兩組細(xì)胞2h后，引起細(xì)胞的GSH水平降低;但在各損傷

7、濃度中，轉(zhuǎn)染組比非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)GSH水平增高（P＜0.05或P＜0.01）。四、彗星實(shí)驗(yàn):用0.03125mM-0.125mM的H2O2作用于兩組細(xì)胞lh后，引起細(xì)胞DNA鏈斷裂，形成彗星樣拖尾;但未轉(zhuǎn)染組各損傷濃度的尾長、尾距及尾DNA含量均明顯大于轉(zhuǎn)染組（P＜0.05或P＜0.01）。
　　 結(jié)論:一、人類TRX基因可以在Neuro-2A細(xì)胞中被重組并順利表達(dá)。TRX基因表達(dá)的TRX具有抗氧化應(yīng)激的作用，對Neuro-2A細(xì)