鎘誘導人肝腎細胞自噬及相關蛋白作用初步研究.pdf

1、已有研究表明鎘（＞20μM）可誘導人肝腎細胞凋亡，但是，鎘能否誘導人肝腎細胞自噬目前還不是很清楚。本研究旨在分析鎘誘導HEK293和WRL68細胞的自噬，及自噬與凋亡的關系。本研究分為三部分:1.構建pcDNA3.1-GFP-LC3B重組質粒，為建立快速檢測細胞自噬的方法打下基礎;2.探究鎘（0～10μM）能否引起HEK293和WRL68胞自噬;3.探究HEK293細胞自噬與凋亡的關系。
　　本實驗運用細胞培養(yǎng)、基因重組及基因轉染

2、、Western blot、流式細胞術、顯微及超微結構觀察等細胞分子生物學技術，構建了pcDNA3.1-GFP-LC3B真核表達載體。檢測了鎘（0～10μM）誘導人肝腎細胞的自噬標志基因LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達;初步探究了自噬過程中ERK1/2和AKT的作用。用流式細胞術檢測了鎘(0～10μM)誘導HEK293細胞的凋亡。探究了自噬抑制劑3-MA對自噬與凋亡的影響，并分析了自噬與凋亡的關系;觀察了極低濃度鎘（0～2.0μM）長時間40 d

3、處理HEK293后細胞形態(tài)變化情況，以分析自噬與和轉化的關系。實驗結果如下:
　　1.通過PCR擴增出LC3B基因，與pcDNA3.1-GFP載體相連，成功構建了pcDNA3.1-GFP-LC3B真核表達載體，且能在HEK293和WRL68細胞中成功表達。
　　2.低濃度鎘（0～10μM）處理HEK293和WRL68細胞，均可引起細胞自噬，表現(xiàn)為LC3B-Ⅱ表達量增加、熒光顯微鏡下轉染細胞出現(xiàn)綠色熒光點狀聚集、透射電鏡下觀察