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文檔簡介
1、研究目的 一、制備Gd-DTPA聚氰基丙烯酸正丁酯納米微粒(Gd-PBCA-NP),并優(yōu)選出最佳的制備方案; 二、在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中靜脈注射Gd-PBCA-NP,并與Gd-DTPA對(duì)照,考察Gd-PBCA-NP肝臟靶向強(qiáng)化效果,并探討其潛在的應(yīng)用價(jià)值; 三、組織間隙注射Gd-PBCA-NP,進(jìn)一步評(píng)估其淋巴組織靶向增強(qiáng)效果,并與SPIO網(wǎng)狀內(nèi)皮陰性對(duì)比劑對(duì)比,評(píng)估兩者在MR淋巴成像中對(duì)良、惡性淋巴結(jié)診斷和鑒別診斷的價(jià)值
2、。 材料和方法 一、Gd-PBCA-NP的制備及優(yōu)化 (一)制備工藝的確定 采用陰離子乳化聚合法,精密稱取一定量Gd-DTPA(V/V)、Dextron-70(W/V),溶于雙蒸水中,用0.1NHCL調(diào)節(jié)PH于酸性狀態(tài),在磁力攪拌器下緩慢加入一定量PBCA單體(V/V),攪拌4h,然后加入一定量1NNaoH調(diào)節(jié)PH于7.0,反應(yīng)終止,隨后用0.45um微孔濾膜過濾,將濾液存于4℃冰箱內(nèi)備用。 (二
3、)單因素初選制備條件 在一定范圍內(nèi),介質(zhì)的PH值、單體濃度、穩(wěn)定劑及藥物濃度是影響NP粒徑大小及其均勻度主要因素。固定其它三種因素于某一條件下,分別考察另一因素在不同條件下對(duì)Gd-PBCA-NP粒徑及其均勻度的影響。 (三)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化制備條件 在單因素初選條件的基礎(chǔ)上,以包封率和載藥量為評(píng)價(jià)指標(biāo),應(yīng)用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)(PH值、Gd-DTPA、PBCA、Dextran-704因素,3個(gè)水平),優(yōu)化制備條
4、件。 (四)Gd-PBCA-NP粒徑及其分布的測定 用Malvern-3000HS激光粒度分析儀測定粒徑及其分布:吸取5ul制備的相應(yīng)樣品,用雙蒸水稀釋至量杯中。所選激光光源波長為633.0nm,測試溫度為25.00±0.05。 (五)Gd-PBCA-NP形態(tài)觀察 取少量上述混合液放置透析袋(截留分子量為1,000,000Da)內(nèi),用5%葡萄糖溶液透析48h,除去游離Gd-DTPA、Dextron-70及
5、無機(jī)離子。用透射電鏡(日立H-600)觀察Gd-PBCA-NP大體形態(tài)。具體操作方法為:1∶4蒸餾水稀釋純凈Gd-PBCA-NP液體,取1滴放在鍍膜銅網(wǎng)上,濾紙吸去多余液體,加入2%磷鎢酸染30s,干燥后電鏡下觀察。 (六)Gd-PBCA-NP包封率及載藥量的測定 取5ml制備的混合液按上述方法透析,透析液總量為2000ml。取20ml透析液(含游離Gd-DTPA)送交廣州科學(xué)院分析測試中心,采用高頻電感耦合等離子發(fā)射光
6、譜法(ICP-AES)測定透析液中Gd離子濃度,按下式計(jì)算Gd-PBCA-NP的包封率及載藥量: 包封率=(Ca-Cs)/Ca×100%載藥量=(Ca-Cs)/CPBCA×100%Ca:母液Gd-DTPA濃度,Cs:透析液Gd-DTPA量CPBCA:母液PBCA濃度 二、Gd-PBCA-NP肝臟靶向性成像研究 (一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 正常清潔級(jí)Wistar大鼠18只,雌雄各半,體重167.5±18.7g,采用隨機(jī)
7、數(shù)字法將其分為三組:1、Gd-DTPA對(duì)照組:劑量為0.1mmol/kg;2、PBCA-NP組:劑量為1ml/100g;3、Gd-PBCA-NP組:劑量為1ml/100g. (二)MRI掃描方法 MRI掃描(SiemensMagnetomVisionPlus1.5T)采用頭部線圈,冠狀及橫斷面掃描,掃描參數(shù)為Turbo-SET1WI(TR/TE=500ms/15ms)和T2WI(TR/TE=2000ms/90ms)。平掃
8、后,各組分別于注藥后5min、15min、30min、1h、2h增強(qiáng)掃描,掃描參數(shù)同平掃。 三、組織間隙注射Gd-PBCA-NP與SPIO在MR淋巴成像中對(duì)照研究 (一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康成年新西蘭白兔24只,由第一軍醫(yī)大學(xué)附屬南方醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,體重2.0~2.5kg,采用隨機(jī)法分為2組:反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組(n=12)、腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組(n=12)。 (二)圖像評(píng)估 1、在不同序列上測量平
9、掃、增強(qiáng)后腘窩淋巴結(jié)的信噪比。分別在T1WIFS、T2WI像上測量Gd-PBCA-NP、SPIO增強(qiáng)后反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組在各時(shí)間點(diǎn)的強(qiáng)化率。在T1WIFS像上,測量各組腘窩淋巴結(jié)的大小。觀察各組增強(qiáng)后淋巴管形態(tài)并計(jì)算淋巴管的顯示數(shù)量。 2、采用雙盲法評(píng)估Gd-PBCA-NP、SPIO對(duì)診斷腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的敏感性、特異性、假陽性率、假陰性率。腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的具體診斷標(biāo)準(zhǔn)為:(1)Gd-PBCA-NP增強(qiáng):在T1WI或T1WIF
10、S上,與平掃相比,淋巴結(jié)信號(hào)不均勻升高或保持不變,診斷為惡性,如信號(hào)均勻升高則診斷為良性; (2)SPIO增強(qiáng):在T2WI或T2*WI像上,與平掃相比,淋巴結(jié)信號(hào)不均勻降低或保持不變,診斷為惡性,如信號(hào)均勻降低則診斷為良性。 (三)病理組織學(xué)檢查 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在完成MRI增強(qiáng)掃描后,用放血法處死動(dòng)物,仔細(xì)暴露腘窩淋巴結(jié),摘除并測量淋巴結(jié)的短徑,計(jì)算淋巴結(jié)數(shù)目。行H-E染色觀察淋巴結(jié)形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化,判別其良惡性。
11、 結(jié)果 一、在一定范圍內(nèi),Gd-PBCA-NP粒徑隨PBCA單體濃度的增加而增加,隨PH增加而增加,隨Dextran-70濃度增加而降低,Gd-DTPA濃度對(duì)Gd-PBCA-NP粒徑無顯著影響。 二、正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溶液的PH值對(duì)Gd-PBCA-NP包封率和載藥量的影響最顯著,Gd-DTPA濃度影響因素最小,Dextran-70濃度和PBCA濃度在選定范圍內(nèi)差異不明顯。確定最佳制備條件為:PH值為2.5,Dext
12、ran-70濃度為1.5%,PBCA濃度為2.0%,Gd-DTPA濃度為20%。 三、透射電鏡觀察Gd-PBCA-NP呈類圓形,大小均勻,表面平滑完整,粒子之間無粘連,具有明顯的核-殼結(jié)構(gòu)。 四、激光粒度分析儀測定Gd-PBCA-NP平均粒徑為65.7nm,粒徑分布為0.09。五、優(yōu)化制備條件下Gd-PBCA-NP的平均包封率和載藥量分別為81.97%、51.23%。 六、Gd-PBCA-NP靜脈注射靜注后5mi
13、n肝實(shí)質(zhì)SNR與平掃相比無顯著性差異;15min,30min,1h,2h肝實(shí)質(zhì)SNR與平掃相比有顯著性差異。肌肉在各時(shí)間點(diǎn)與平掃相比無顯著性差異。靜脈注射Gd-DTPA后,在第5min、10min肝臟SNR較高,而第30分鐘、1h、2h同增強(qiáng)前肝臟SNR基本處于同一水平。PBCA-NP靜脈注射后在各時(shí)間點(diǎn)肝實(shí)質(zhì)、肌肉SNR與平掃對(duì)比無顯著性差異。 七、靜脈注射Gd-DTPA后5min、15min肝實(shí)質(zhì)強(qiáng)化程度平均為35.2%、4
14、8.6%同時(shí)可見腎實(shí)質(zhì)也明顯強(qiáng)化,30min,肝實(shí)質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度恢復(fù)到平掃前水平。靜注Gd-PBCA-NP后5min,肝實(shí)質(zhì)強(qiáng)化程度平均為3.4%,15min、30min、1h、2h肝實(shí)質(zhì)強(qiáng)化程度平均為22.7%,36.1%、56.4%、24.8%,與Gd-DTPA組、PBCA-NP組肝實(shí)質(zhì)強(qiáng)化方式明顯不同。 八、反應(yīng)性增生淋巴結(jié)和腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)均制作成功,平掃兩組腘窩淋巴結(jié)在各序列圖像上的SNR、大小均無顯著性差異,但腫瘤轉(zhuǎn)移性
15、淋巴結(jié)平均直徑大于反應(yīng)性增生淋巴結(jié)。 一.Gd-DTPA-NP粒徑與PH值、單體濃度呈正相關(guān),與Dextran-70濃度呈負(fù)相關(guān)。 二.優(yōu)化Gd-DTPA-NP的制備條件為:PH值為2.5,Dextran-70濃度為1.5%,PBCA濃度為2.0%,Gd-DTPA濃度為20%。Gd-DTPA-NP包封率及載藥量分別為81.97%、51.23%,粒徑為65.7nm,大體形態(tài)呈類圓形,具有明顯的核-殼結(jié)構(gòu)。 三、靜脈
16、注射Gd-PBCA-NP后,在T1WI像上大鼠肝臟呈靶向性強(qiáng)化,說明Gd-PBCA-NP可以作為MR網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞特異性對(duì)比劑。 四、靜脈注射Gd-PBCA-NP后,大鼠肝臟最大強(qiáng)化幅度達(dá)56.4%,強(qiáng)化峰值出現(xiàn)在24h左右。 五、MRI平掃難以準(zhǔn)確區(qū)分反應(yīng)性增生淋巴結(jié)和腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)。六、與SPIO類似,Gd-PBCA-NP組織間隙注射可用來進(jìn)行MRI淋巴造影。 七、組織間隙注射Gd-PBCA-NP后,反應(yīng)性淋
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