新型MR對(duì)比劑長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂質(zhì)體納米微粒制備的初步研究及MR-DWI在鑒別中央型肺癌與繼發(fā)阻塞性肺實(shí)變中的價(jià)值.pdf

1、研究目的：
　　 嘗試制備新型MR對(duì)比劑長(zhǎng)循環(huán)SPIO(Superparamagnetic Iron Oxide)脂質(zhì)體納米微粒,并對(duì)其理化性質(zhì)及藥效學(xué)進(jìn)行測(cè)定和初步評(píng)價(jià)。
　　 材料和方法
　　 1 新型MR對(duì)比劑長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂質(zhì)體納米微粒的制備及理化性質(zhì)的測(cè)定
　　 1.1長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂質(zhì)體納米微粒的制備
　　 分三步完成:(1)按摩爾比20:1精密稱(chēng)取一定量DSPG、DSPE-PEG20

2、00,采用薄膜分散法合成長(zhǎng)循環(huán)空白脂質(zhì)體納米微粒；(2)采用化學(xué)共沉淀法,在堿性條件下與月桂酸反應(yīng)形成月桂酸穩(wěn)定的SPIO納米微粒；(3)將上述反應(yīng)產(chǎn)物以一定比例混合,加入TES緩沖液(5mM,PH=7.0),透析3天,過(guò)凝膠柱去除過(guò)大的脂質(zhì)體及游離的磷脂。
　　 1.2長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂質(zhì)體納米微粒理化性質(zhì)的測(cè)定
　　 2 新型MR對(duì)比劑長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂質(zhì)體納米微粒藥效學(xué)的初步評(píng)價(jià)
　　 2.1巨噬細(xì)胞的體外吞噬

3、實(shí)驗(yàn):用含10％胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基于37℃,5％CO2條件下培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞24h后,細(xì)胞達(dá)到80-90％匯合,以0.025％胰酶-0.2％EDTA消化細(xì)胞,接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,5×105個(gè)/孔,孵化24小時(shí)后,用PBS液洗三遍后,加入含鐵量800μg的空白SPIO和長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂質(zhì)體的DMEM全培溶液2ml,孵化24h后,用PBS液洗三遍,以未加入SPIO溶液的細(xì)胞作為空白對(duì)照,每孔分別加入1ml4％的多聚

4、甲醛溶液,固定20分鐘后,加入由2％亞鐵氰化鉀溶液和2％鹽酸(體積比2:1)混合液1ml,于37℃,孵化30分鐘后,用PBS液洗三遍,倒置顯微鏡下觀察,拍照比較RAW264.7細(xì)胞與含上述溶液培養(yǎng)基孵化24h后經(jīng)普魯士藍(lán)染色后顏色的差異。
　　 2.2小鼠藥物體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)
　　 2.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:C57BL/6J雄性小鼠6只,體重12～15g,由南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物教研室饋贈(zèng),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。<

5、br>　　 2.2.2主要儀器與試劑:石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica RM2155),Olympus顯微鏡(日本奧林巴斯公司),空白SPIO(南方醫(yī)院影像中心許乙凱教授提供),長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂質(zhì)體溶液(按前述方法制備)。
　　 2.2.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方法:上述6只小鼠,隨機(jī)設(shè)為空白對(duì)照組(n=2)、空白SPIO組(n=2)、長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂質(zhì)體組(n=2)；經(jīng)小鼠尾靜脈分別緩慢注射0.05ml生理鹽水、空白SPIO溶液以及長(zhǎng)循環(huán)S

6、PIO脂質(zhì)體溶液(10mgFe/kg)；12小時(shí)后行頸椎脫臼法處死動(dòng)物,快速取其肝臟、脾臟、心臟、肺臟以及腎臟組織,用10％福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,做Perls Prussian-blue染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察。
　　 2.3荷肺癌裸鼠MR成像實(shí)驗(yàn)
　　 2.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和瘤株:SPF級(jí)4周齡BALB/C雄性裸鼠20只,體重15～19g,按照細(xì)胞懸液密度約1×107個(gè)/ml,于上述BALB/c裸鼠右側(cè)腋部皮

7、下接種人A549細(xì)胞懸液0.2ml,無(wú)菌飼養(yǎng)2～3周。
　　 2.3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:采用隨機(jī)數(shù)字法將其分成兩組:空白SPIO組(n=10)和長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂質(zhì)體組(n=10)。
　　 2.3.3 MRI掃描方法:平掃采用膝關(guān)節(jié)線(xiàn)圈,掃描序列參數(shù)如下:FSE-T2WI(TR:4000ms,TE:84.7ms),SE-T1WI(TR:420ms,TE:10.6ms),FOV:10×10cm,層厚1.5mm。平掃結(jié)束后,于上

8、述裸鼠尾靜脈分別注射對(duì)比劑空白SPIO以及長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂質(zhì)體(10mgFe/kg),并于5min、30min、1h、3h、6h、9h、12h、24h后行T2WI-MR增強(qiáng)掃描,掃描序列及參數(shù)同平掃。掃描結(jié)束后處死裸鼠,分別取兩組腫瘤組織行普魯士藍(lán)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。
　　 2.3.4圖像觀察與測(cè)量:在T2WI像上測(cè)量平掃及增強(qiáng)后兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)肝臟及腫瘤感興趣區(qū)的信號(hào)強(qiáng)度及背景噪聲標(biāo)準(zhǔn)差,計(jì)算出信噪比,繪制兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

9、平掃及增強(qiáng)后各時(shí)間點(diǎn)肝臟及腫瘤的信噪比-時(shí)間動(dòng)態(tài)變化曲線(xiàn),并計(jì)算兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平掃及增強(qiáng)后12h肝臟及腫瘤的信噪比下降百分比。
　　 2.3.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包,采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)比較各組動(dòng)物腫瘤及肝臟平掃和增強(qiáng)后12h信噪比有無(wú)差異；采用協(xié)方差分析在扣除各組動(dòng)物肝臟及腫瘤初始信噪比差異下比較兩組動(dòng)物肝臟及腫瘤增強(qiáng)12h后信噪比有無(wú)顯著性差異。P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。
　　 2.4藥物細(xì)胞毒

10、性實(shí)驗(yàn)(MTT法):吸取復(fù)蘇后培養(yǎng)的人肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞懸液離心洗滌,1000rpm,3min。培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù),以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,37℃,5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)。棄去上清液,用D-hanks液洗兩遍后,分別加入空白SPIO溶液及長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂質(zhì)體溶液,濃度分別為每孔鐵含量為10μg,20μg,40μg,80μg,120μg,160μg和200μg的上述納米?；鞈乙汉?0％胎牛血清的培養(yǎng)液200μl

11、,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。另外,以?xún)H含培養(yǎng)基,不含細(xì)胞的作為調(diào)零孔；以?xún)H含正常培養(yǎng)細(xì)胞的為正常對(duì)照孔；以只加入上述納米粒的為樣品對(duì)照孔。培養(yǎng)24小時(shí)后,加入濃度為5mg/ml的MTT的D-hanks溶液,每孔20μl,于37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵化4h后,吸去上清液,每孔加入200μl二甲基亞砜,于平板震蕩儀上震蕩10分鐘,在490nm的波長(zhǎng)處于酶標(biāo)儀中測(cè)定吸光度值(OD值),比色時(shí),以空白孔調(diào)零。計(jì)算細(xì)胞存活率,公式為:細(xì)胞存活率=(樣

12、品孔的OD值-樣品對(duì)照孔的OD值)/正常對(duì)照孔的OD值。
　　 結(jié)論
　　 本文制備的長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂質(zhì)體納米微粒粒徑大小適宜,分布均勻,在體內(nèi)外均有較好的抗巨噬系統(tǒng)吞噬功能,在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)循環(huán),使SPIO不僅僅局限作用于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),對(duì)非網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)腫瘤也具有良好的T2負(fù)性被動(dòng)靶向強(qiáng)化效果,另外降低了SPIO對(duì)細(xì)胞的毒性作用。
　　 不足之處
　　 本文僅是初步研究,局限于新型MR對(duì)比劑長(zhǎng)循環(huán)SPIO脂

13、質(zhì)體的初步合成及其長(zhǎng)循環(huán)功能和被動(dòng)靶向作用的驗(yàn)證,藥物制備工藝尚不完善,且未在脂質(zhì)體表面聯(lián)上特異性功能基團(tuán)(抗體或受體)凸顯其主動(dòng)靶向作用,這在我們的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將得到進(jìn)一步體現(xiàn)。
　　 研究目的：
　　 前瞻性研究MR擴(kuò)散加權(quán)成像在鑒別中央型肺癌與繼發(fā)阻塞性肺實(shí)變中的價(jià)值。
　　 材料和方法
　　 1 臨床資料:對(duì)2009年3月1日～2010年2月21日間經(jīng)病理確診為肺癌的20例符合以下條件的患者行MR胸

14、部掃描:(1)已有影像學(xué)資料(平片、CT或PET-CT)提示肺癌合并肺不張；(2)未接受過(guò)放療、化療等抗腫瘤治療；(3)一般情況良好,無(wú)嚴(yán)重心血管疾病,無(wú)肝腎功能障礙,能配合完成MR檢查；(4)體內(nèi)無(wú)金屬物(心臟支架、起搏器、心臟人工瓣膜等)或其他MR檢查禁忌。
　　 2 MR掃描方法:采用GE 1.5T超導(dǎo)MR掃描儀,所有病例均行T1-SE、T2*FGRE、T2-FRFSE、FIESTA以及DWI各序列的檢查,所有序列均采用外

15、周脈搏及呼吸門(mén)控。
　　 3 圖像分析:由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的影像診斷醫(yī)師經(jīng)商議后作出結(jié)論。選擇顯示腫瘤與阻塞性肺實(shí)變并存或鄰近的2個(gè)相鄰層面作為感興趣區(qū)(region of interest,ROI)所選層面。
　　 彌散圖像測(cè)量:在ADC圖上分別測(cè)量各個(gè)ROI的ADC值,在2種b值的DWI圖像上測(cè)量腫瘤與阻塞性肺實(shí)變的信號(hào)強(qiáng)度平均值、圖像背景噪聲平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。計(jì)算DWI上病變區(qū)(腫瘤及阻塞性肺實(shí)變)的圖像信噪比、腫瘤-阻

16、塞性肺實(shí)變的信號(hào)強(qiáng)度比和腫瘤-阻塞性肺實(shí)變的對(duì)比噪聲比。
　　 常規(guī)圖像信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量:采用同樣的方法,在T2*FGRE、T2-FRFSE、FIESTA各序列上測(cè)量腫瘤及阻塞性肺實(shí)變區(qū)的信號(hào)強(qiáng)度值,計(jì)算相應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度比。
　　 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS for windows(SPSS13.0)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入及統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)兩種b值DWI圖像病變區(qū)(包括瘤體與阻塞性實(shí)變區(qū))SNR、SIR、CNR的比較,

17、對(duì)相同b值不同病變區(qū)ADC值差異,對(duì)不同b值時(shí)相同病變區(qū)ADC值的差異,DWI與T2*FGRE、T2-FRFSE、FIESTA圖像的SIR比較以及不同b值相同病理類(lèi)型腫瘤瘤體ADC值差異均采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；對(duì)相同b值不同病理類(lèi)型瘤體ADC值的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析,多重比較選用LSD法。P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。
　　 結(jié)論
　　 伴有阻塞性肺實(shí)變的中央型肺癌其瘤體在DWI上呈明亮高信號(hào),繼發(fā)的阻塞性