精子生殖源性血管緊張素轉(zhuǎn)換酶缺乏致常規(guī)體外受精中完全受精失敗和低受精率的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分精子生殖源性ACE缺乏致常規(guī)體外受精中完全受精失敗和低受精率
　　目的:
　　分析常規(guī)IVF中完全受精失敗和低受精率的相關(guān)臨床因素分析，了解精子gACE和ADAM2在體外受精中受精失敗男性患者中的表達(dá)變化。
　　材料和方法:
　　1.收集本中心行常規(guī)IVF男性患者的剩余精子標(biāo)本，加入凍存液-80℃冰箱保存。參照文獻(xiàn)患者篩選標(biāo)準(zhǔn)為:①女方年齡≤38歲，②該周期獲取正常成熟卵子數(shù)目≥3個(gè)，未成熟卵、畸形卵、過(guò)

2、熟卵及存在某些其他異常類型的卵都剔除本研究，③男方精子標(biāo)準(zhǔn)為，精子總數(shù)＞20×106并且前向運(yùn)動(dòng)精子活動(dòng)率＞20％。
　　2.收集本中心行睪丸穿刺取精術(shù)或睪丸活檢術(shù)患者的剩余睪丸組織標(biāo)本，放置-80℃冰箱保存。其中唯支持細(xì)胞綜合征患者10例，生精功能組織患者10例，正常生精功能患者10例。
　　3.按照其受精情況將病例分為T(mén)FF組（40例患者）、LFR組（50例患者）和NFR組（50例患者）。
　　4.分析TFF組、L

3、FR組及NFR組病例男女方年齡、不孕年限，獲得成熟卵數(shù)、受精率、精子濃度、精子前向精子活動(dòng)力及不育原因等臨床一般資料數(shù)據(jù)。
　　5.通過(guò)western blotting技術(shù)，檢測(cè)不同生精狀態(tài)的睪丸及正常形態(tài)精子gACE及ADAM2的表達(dá)情況。
　　6.通過(guò)western blotting技術(shù)，檢測(cè)TFF組、LFR組及NFR組病例精子gACE及ADAM2的表達(dá)水平。
　　7.通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)gACE在人精子的表

4、達(dá)情況，并檢測(cè)TFF組、LFR組及NFR組病例精子gACE的表達(dá)水平。
　　8.通過(guò)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)部分TFF組、LFR組及NFR組病例精子gACE及 ADAM2的表達(dá)水平。
　　9.觀察精子在獲能前、獲能后及誘導(dǎo)發(fā)生頂體反應(yīng)后gACE表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:
　　1.常規(guī)IVF中TFF組、LFR組及NFR組病例男女方患者的年齡、不孕年限及獲成熟卵數(shù)均無(wú)顯著性差異。
　　2.常規(guī)IVF中TFF組、LF

5、R組及NFR組病例獲卵當(dāng)日精液質(zhì)量常規(guī)參數(shù)比較，其精子濃度及前向運(yùn)動(dòng)精子活動(dòng)力呈顯著性差異。TFF組及LFR組病例的精子濃度及前向運(yùn)動(dòng)精子活動(dòng)力均低于對(duì)照組NFR組。但TFF組及LFR組病例之間的精子濃度及前向運(yùn)動(dòng)精子活動(dòng)力無(wú)顯著性差異。
　　3.常規(guī)IVF中TFF組、LFR組不明原因性不育及原發(fā)不育比例高于NFR組。
　　4.sACE在唯支持細(xì)胞綜合征、生精功能障礙及正常生精功能的患者睪丸中表達(dá)，但是在精子不表達(dá)。

6、　　5.gACE在正常生精功能的患者睪丸中表達(dá)，但在唯支持細(xì)胞綜合征及生精功能障礙的患者睪丸中不表達(dá)。
　　6.gACE表達(dá)于人精子中頂體后區(qū)、頸部及中段。
　　7.常規(guī)IVF中TFF組、LFR組及NFR組三組之間gACE蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著性差異。與對(duì)照組NFR組比較，TFF組及LFR組患者的gACE蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于NFR組。但是TFF組及LFR組患者之間的gACE蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異
　　8.gACE蛋白

7、表達(dá)水平在37.5％(15/40)的TFF組及20％(10/50)的LFR組病例精子表達(dá)水平下調(diào)。
　　9.在原發(fā)不育患者中，gACE蛋白表達(dá)水平在53.8％(15/28)的TFF組患者及45.5％(10/22)的LFR組患者中下調(diào)。
　　10.ADAM2表達(dá)水平常規(guī)IVF中TFF組、LFR組及NFR組病例精子中表達(dá)水平無(wú)顯著性差異。
　　11.鈣離子載體A23157誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)。獲能前、獲能后及A23157誘

8、導(dǎo)后gACE蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1.常規(guī)IVF中完全受精失敗和低受精率與獲卵當(dāng)日精子濃度及前向精子活動(dòng)力相關(guān)。
　　2.原發(fā)不育及不明原因性不育患者行常規(guī)IVF時(shí)存在完全受精失敗和低受精率高風(fēng)險(xiǎn)。
　　3.男性精子gACE的正常表達(dá)是受精過(guò)程完成的關(guān)鍵條件。
　　第二部分精子生殖源性ACE缺乏致常規(guī)體外受精中完全受精失敗和低受精率的機(jī)制研究
　　目的:
　　觀察篩選gAC

9、E特異調(diào)控區(qū)域及全部外顯子DNA序列是否發(fā)生變化。分析發(fā)現(xiàn)的gACE SNP位點(diǎn)與患者受精失敗之間的相關(guān)性。驗(yàn)證該基因SNP位點(diǎn)對(duì)gACE轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　方法:
　　1.收集本中心行常規(guī)IVF男性患者的剩余精子標(biāo)本，加入凍存液-80℃冰箱保存。參照文獻(xiàn)患者篩選標(biāo)準(zhǔn)為:①女方年齡≤38歲，②該周期獲取正常成熟卵子數(shù)目≥3個(gè)，未成熟卵、畸形卵、過(guò)熟卵及存在某些其他異常類型的卵都剔除本研究，③男方精子標(biāo)準(zhǔn)為，精子總數(shù)＞20×

10、106并且前向運(yùn)動(dòng)精子活動(dòng)率＞20％。
　　2.按照其受精情況將病例分為T(mén)FF組（40例患者）、LFR組（50例患者）和NFR組（50例患者）。
　　3.PCR擴(kuò)增和測(cè)序方法篩選gACE低表達(dá)患者其基因特異調(diào)控區(qū)域DNA序列是否發(fā)生變化。
　　4.設(shè)計(jì)PCR-RFLP方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)，并檢測(cè)SNP位點(diǎn)在常規(guī)IVF男性患者的分布情況。
　　5.利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證SNP位點(diǎn)對(duì)gACE的轉(zhuǎn)錄水平

11、影響。
　　6.PCR擴(kuò)增和測(cè)序方法篩選gACE全部外顯子DNA序列是否發(fā)生變化。
　　結(jié)果:
　　1.92％ gACE表達(dá)下降患者(23/25) SNP rs4316的基因型為T(mén)T，SNP rs4320的基因型為aa。
　　2.rs4316等位基因T的頻率與rs4320等位基因a的頻率呈連鎖相關(guān)。
　　3.與NFR組比較，TFF組及LFR組中rs4316的TT基因型沒(méi)有顯著性升高，但是TFF組與LFR組整

12、合后比較，其TT基因型高于NFR組。
　　4.LFR組中rs4316等位基因T的頻率高于NFR組。
　　5.雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，SNP rs4316 T等位基因與C等位基因相比，可下調(diào)熒光素酶的活性。
　　6.一完全受精失敗患者檢測(cè)到gACE新的雜合子突變(pSer1005Cys)。
　　結(jié)論:
　　1.rs4316等位基因T及rs4320等位基因a與受精失敗相關(guān)。
　　2.SNP rs4316