精子生殖源性血管緊張素轉(zhuǎn)換酶缺乏致常規(guī)體外受精中完全受精失敗和低受精率的機制研究.pdf

1、第一部分精子生殖源性ACE缺乏致常規(guī)體外受精中完全受精失敗和低受精率
　　目的:
　　分析常規(guī)IVF中完全受精失敗和低受精率的相關(guān)臨床因素分析，了解精子gACE和ADAM2在體外受精中受精失敗男性患者中的表達變化。
　　材料和方法:
　　1.收集本中心行常規(guī)IVF男性患者的剩余精子標本，加入凍存液-80℃冰箱保存。參照文獻患者篩選標準為:①女方年齡≤38歲，②該周期獲取正常成熟卵子數(shù)目≥3個，未成熟卵、畸形卵、過

2、熟卵及存在某些其他異常類型的卵都剔除本研究，③男方精子標準為，精子總數(shù)＞20×106并且前向運動精子活動率＞20％。
　　2.收集本中心行睪丸穿刺取精術(shù)或睪丸活檢術(shù)患者的剩余睪丸組織標本，放置-80℃冰箱保存。其中唯支持細胞綜合征患者10例，生精功能組織患者10例，正常生精功能患者10例。
　　3.按照其受精情況將病例分為TFF組（40例患者）、LFR組（50例患者）和NFR組（50例患者）。
　　4.分析TFF組、L

3、FR組及NFR組病例男女方年齡、不孕年限，獲得成熟卵數(shù)、受精率、精子濃度、精子前向精子活動力及不育原因等臨床一般資料數(shù)據(jù)。
　　5.通過western blotting技術(shù)，檢測不同生精狀態(tài)的睪丸及正常形態(tài)精子gACE及ADAM2的表達情況。
　　6.通過western blotting技術(shù)，檢測TFF組、LFR組及NFR組病例精子gACE及ADAM2的表達水平。
　　7.通過間接免疫熒光技術(shù)，檢測gACE在人精子的表

4、達情況，并檢測TFF組、LFR組及NFR組病例精子gACE的表達水平。
　　8.通過定量PCR技術(shù)，檢測部分TFF組、LFR組及NFR組病例精子gACE及 ADAM2的表達水平。
　　9.觀察精子在獲能前、獲能后及誘導(dǎo)發(fā)生頂體反應(yīng)后gACE表達量的變化。
　　結(jié)果:
　　1.常規(guī)IVF中TFF組、LFR組及NFR組病例男女方患者的年齡、不孕年限及獲成熟卵數(shù)均無顯著性差異。
　　2.常規(guī)IVF中TFF組、LF

5、R組及NFR組病例獲卵當日精液質(zhì)量常規(guī)參數(shù)比較，其精子濃度及前向運動精子活動力呈顯著性差異。TFF組及LFR組病例的精子濃度及前向運動精子活動力均低于對照組NFR組。但TFF組及LFR組病例之間的精子濃度及前向運動精子活動力無顯著性差異。
　　3.常規(guī)IVF中TFF組、LFR組不明原因性不育及原發(fā)不育比例高于NFR組。
　　4.sACE在唯支持細胞綜合征、生精功能障礙及正常生精功能的患者睪丸中表達，但是在精子不表達。

6、　　5.gACE在正常生精功能的患者睪丸中表達，但在唯支持細胞綜合征及生精功能障礙的患者睪丸中不表達。
　　6.gACE表達于人精子中頂體后區(qū)、頸部及中段。
　　7.常規(guī)IVF中TFF組、LFR組及NFR組三組之間gACE蛋白相對表達量呈顯著性差異。與對照組NFR組比較，TFF組及LFR組患者的gACE蛋白相對表達量均低于NFR組。但是TFF組及LFR組患者之間的gACE蛋白相對表達量無顯著性差異
　　8.gACE蛋白

7、表達水平在37.5％(15/40)的TFF組及20％(10/50)的LFR組病例精子表達水平下調(diào)。
　　9.在原發(fā)不育患者中，gACE蛋白表達水平在53.8％(15/28)的TFF組患者及45.5％(10/22)的LFR組患者中下調(diào)。
　　10.ADAM2表達水平常規(guī)IVF中TFF組、LFR組及NFR組病例精子中表達水平無顯著性差異。
　　11.鈣離子載體A23157誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)。獲能前、獲能后及A23157誘

8、導(dǎo)后gACE蛋白表達水平無顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1.常規(guī)IVF中完全受精失敗和低受精率與獲卵當日精子濃度及前向精子活動力相關(guān)。
　　2.原發(fā)不育及不明原因性不育患者行常規(guī)IVF時存在完全受精失敗和低受精率高風險。
　　3.男性精子gACE的正常表達是受精過程完成的關(guān)鍵條件。
　　第二部分精子生殖源性ACE缺乏致常規(guī)體外受精中完全受精失敗和低受精率的機制研究
　　目的:
　　觀察篩選gAC

9、E特異調(diào)控區(qū)域及全部外顯子DNA序列是否發(fā)生變化。分析發(fā)現(xiàn)的gACE SNP位點與患者受精失敗之間的相關(guān)性。驗證該基因SNP位點對gACE轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　方法:
　　1.收集本中心行常規(guī)IVF男性患者的剩余精子標本，加入凍存液-80℃冰箱保存。參照文獻患者篩選標準為:①女方年齡≤38歲，②該周期獲取正常成熟卵子數(shù)目≥3個，未成熟卵、畸形卵、過熟卵及存在某些其他異常類型的卵都剔除本研究，③男方精子標準為，精子總數(shù)＞20×

10、106并且前向運動精子活動率＞20％。
　　2.按照其受精情況將病例分為TFF組（40例患者）、LFR組（50例患者）和NFR組（50例患者）。
　　3.PCR擴增和測序方法篩選gACE低表達患者其基因特異調(diào)控區(qū)域DNA序列是否發(fā)生變化。
　　4.設(shè)計PCR-RFLP方法檢測發(fā)現(xiàn)的SNP位點，并檢測SNP位點在常規(guī)IVF男性患者的分布情況。
　　5.利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證SNP位點對gACE的轉(zhuǎn)錄水平

11、影響。
　　6.PCR擴增和測序方法篩選gACE全部外顯子DNA序列是否發(fā)生變化。
　　結(jié)果:
　　1.92％ gACE表達下降患者(23/25) SNP rs4316的基因型為TT，SNP rs4320的基因型為aa。
　　2.rs4316等位基因T的頻率與rs4320等位基因a的頻率呈連鎖相關(guān)。
　　3.與NFR組比較，TFF組及LFR組中rs4316的TT基因型沒有顯著性升高，但是TFF組與LFR組整

12、合后比較，其TT基因型高于NFR組。
　　4.LFR組中rs4316等位基因T的頻率高于NFR組。
　　5.雙熒光素酶報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，SNP rs4316 T等位基因與C等位基因相比，可下調(diào)熒光素酶的活性。
　　6.一完全受精失敗患者檢測到gACE新的雜合子突變(pSer1005Cys)。
　　結(jié)論:
　　1.rs4316等位基因T及rs4320等位基因a與受精失敗相關(guān)。
　　2.SNP rs4316