CD200與CD133+Colo205大腸癌細胞共表達及成瘤實驗研究.pdf

1、背景和目的：
　　 大腸癌是嚴重危害人類健康也是最常見的惡性腫瘤之一，在西方發(fā)達國家其發(fā)病率居于惡性腫瘤的第2位，在我國隨著人類生活水平的提高及膳食結構的改變，其發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升趨勢。但是，由于大腸癌起病隱匿、進展較快、早期診斷困難，患者就診時常處于中晚期，故失去手術機會的病例較多，部分患者接受放化療后仍早期復發(fā)，直接導致大腸癌預后差，病死率高，所以研究大腸癌的發(fā)病機制，尋找治療靶點，對大腸癌的治療非常重要。腫瘤的發(fā)生

2、、發(fā)展是一個多因素參與、多基因改變、多步驟發(fā)展的復雜過程。在腫瘤的研究過程中，人們提出的腫瘤干細胞學說認為腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織中極少量的腫瘤細胞亞群，具有自我更新、增殖、分化、強致瘤性等潛能，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)、轉移和耐藥密切相關。腫瘤干細胞則是腫瘤不斷生長、腫瘤復發(fā)與轉移的罪魁禍首，因此，腫瘤干細胞已成為腫瘤研究的熱點。
　　 目前，惡性腫瘤常見的腫瘤干細胞標志物有CD133、CD44、ESA、ALDH1等，其中CD

3、133是目前被多數(shù)學者公認的腫瘤干細胞標志物，分選CD133+腫瘤干細胞亞群是富集大腸癌干細胞的一種有效方法，已應用于多種類型腫瘤干細胞的篩選。Fang DD等發(fā)現(xiàn)CD133+大腸癌細胞亞群是具有干細胞特征，認為CD133是大腸癌干細胞的標志物。Dalerba P等研究證明CD44是大腸癌干細胞標志物。我們前期的研究將Colo205細胞進行無血清培養(yǎng)和聯(lián)合檢測CD133及CD44的表達，為本實驗對大腸癌干細胞的研究奠定基礎。
　　

4、 腫瘤免疫編輯學說認為在腫瘤的整個發(fā)展過程中，機體免疫系統(tǒng)和腫瘤細胞之間存在著相互作用，免疫系統(tǒng)重塑腫瘤細胞的抗原性，腫瘤細胞影響著免疫系統(tǒng)的功能。從細胞發(fā)生惡性轉化開始到臨床上出現(xiàn)可檢測到的腫瘤為止，免疫系統(tǒng)和腫瘤細胞之間的相互作用分為三個階段:清除階段，平衡階段，逃逸階段。在腫瘤發(fā)生之前，免疫系統(tǒng)會識別腫瘤細胞和起到免疫殺傷作用。但是，腫瘤干細胞可以利用免疫逃逸機制，可能對腫瘤產(chǎn)生免疫抑制或免疫耐受。由此可見，大腸癌腫瘤干細胞的存

5、在與腫瘤免疫之間的密切關系，是使腫瘤不斷發(fā)展的重要原因。
　　 腫瘤干細胞理論指出結腸癌的發(fā)病、轉移與復發(fā)與大腸癌干細胞有關。然而，機體免疫系統(tǒng)對大腸癌干細胞的免疫識別、大腸癌腫瘤干細胞在誘導腫瘤免疫調節(jié)和免疫耐受的作用及其機制仍然不明確，針對大腸癌干細胞免疫治療也在起始階段。因此，進一步探討和研究大腸癌干細胞與腫瘤免疫之間的關系至關重要。
　　 研究表明CD200具有免疫調節(jié)作用，CD200是一種Ⅰ型膜糖蛋白，是高度保

6、守的免疫超家族成員，可以表達在骨髓系統(tǒng)的細胞中包括巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞，同樣表達在B細胞、活化T細胞等。MoreauxJ等證實CD200 mRNA高表達于結腸癌、腎癌、頭頸部癌等腫瘤中，并且高表達者具有更差的預后。Kawasaki BT等通過流式檢測發(fā)現(xiàn)CD200與前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、結腸癌的腫瘤干細胞表面標志物例如CD44，CD133等共表達，提出CD200可能是前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、結腸癌的

7、腫瘤干細胞的表面標志物之一。最近研究已證實CD200在器官移植、自身免疫疾病、腫瘤免疫中有重要的作用并與疾病的發(fā)生、發(fā)展有關。為此讓CD200在大腸癌干細胞研究奠定了基礎，也提示CD200介導的大腸癌干細胞與腫瘤免疫密切相關。目前，CD200在大腸癌的研究仍處于初步階段，本實驗對CD200與大腸癌細胞CD133及ALDH1共表達及其之間的相互關系進行初步研究。為CD200介導的大腸癌腫瘤免疫研究，以及大腸癌預后的指導、靶向治療等方面提供

8、了新的科研視角。因此，研究CD200與大腸癌于細胞之間的關系，尋找治療的靶點，對大腸癌的治療至關重要。
　　 材料與方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)含血清培養(yǎng)基(serum-supplimented medium，SSM)為10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基（serum-free medium，SFM）由DMEM/F12(1∶1)、B27(1∶50)、EGF(20ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、L

9、IF(10ng/ml)組成。將Colo205細胞接種于SSM中培養(yǎng)，細胞處于生長期時用PBS液清洗，胰酶消化，重懸Colo205細胞接種到SFM中進行培養(yǎng)。
　　 2.流式細胞檢測離心收集SSM組和SFM組（培養(yǎng)2周）的Colo205細胞，分別取80ul細胞懸液（約含106個細胞），加入FCR阻斷劑、Anti-CD200-APC、Anti-CD133-PE標記，4℃孵育20分鐘，并設有同型對照組，上機檢測CD133+CD200-

10、、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-細胞的比例。
　　 3.細胞免疫熒光將SFM組的腫瘤細胞離心收集，以SSM組作為對照，加PBS重懸細胞后涂片，4％多聚甲醛固定，0.2％ Triton X-100破膜，10％正常山羊血清封閉，加入鼠抗人CD133抗體、兔抗人ALDH1抗體（或鼠抗人CD200抗體、兔抗人ALDH1抗體）混勻4℃孵育過夜，PBS洗滌后加入anti-mouse-594、an

11、ti-rabbit-488熒光標記二抗，并設有陰性對照，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染細胞核，抗熒光淬滅劑封片，鏡檢。
　　 4.流式細胞分選將SFM組大腸癌細胞離心收集（約1×108個細胞），加入FCR阻斷劑、Anti-CD200-APC、Anti-CD133-PE標記，4℃孵育20分鐘，上機進行流式細胞分選，并分選出CD133+CD200-、CD133

12、-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-四組細胞，培養(yǎng)后再進行第二次流式細胞檢測。
　　 5.倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)及生長狀況倒置顯微鏡觀察含血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基中Colo205細胞的形態(tài)和生長狀況;用同樣的方法觀察無血清培養(yǎng)基中CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-細胞的形態(tài)和生長狀況。
　　 6.NOD/SCID小鼠皮下成

13、瘤實驗動物實驗經(jīng)過南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院倫理委員會審核批準，并在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院實驗動物中心SPF級飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)。將分選后的CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-細胞，分別用PBS重懸，取100ul單個細胞懸液與100ul Matrigel膠1∶1(V/V)混合，并分別按103、104、105個CD133+CD200-、CD133-CD200+及CD133+CD200+

14、細胞無菌皮下注射注入NOD/SCID小鼠左上背部，并以同樣細胞數(shù)的CD133-CD200-細胞注射右下背部作為對照。每2天觀察一次，用游標卡尺測量瘤體大小，記錄瘤體的變化，瘤體體積用以下公式計:V=(π×L×W2)/6(V，體積;L，長;W，寬)，繪制成瘤生長曲線，32天后將NOD/SCID小鼠安樂死，剔除出腫瘤組織。
　　 7.HE染色和免疫組織化學染色HE染色:將小鼠的皮下腫瘤組織用4％多聚甲醛固定，乙醇和二甲苯脫水和透明，

15、石蠟包埋、石蠟切片HE染色。免疫組化染色:石蠟切片，用二甲苯、乙醇脫蠟和水化，3％過氧化氫孵育，加入EDTA抗原修復液并于微波爐進行抗原修復，PBS洗滌后加10％正常山羊血清封閉，兔抗人ALDH1抗體(1∶200)4℃孵育過夜，以PBS代替一抗作陰性對照，加入二抗，DAB顯色，蘇木素復染，分化和返藍，乙醇脫水和二甲苯透明，中性樹膠封片。
　　 8.統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗結果用均數(shù)±標準差表示，兩組

16、均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗和兩個獨立樣本非參數(shù)檢驗，多組均數(shù)比較采用One-Way ANOVA和多個獨立樣本參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.流式檢測CD133+細胞與CD200+細胞的比例在SSM組Colo205細胞CD133+CD200-、CD133-CD200+及CD133+CD200+細胞的比例分別為(1.68±0.94)％、(0.94±0.67)％、(0.68±0.22)％，

17、而在SFM組的比例分別為(19.72±2.36)％、（9.56±1.00）％、（3.02±0.93）％，兩組間各細胞比例差異有統(tǒng)計學意義，P值均小于0.05。SFM組CD133+CD200-、CD133-CD200+和CD133+CD200+細胞的比例均高于SSM組。將Colo205細胞在SFM中進行培養(yǎng)，CD133+CD200-、CD133-CD200+和CD133+CD200+細胞的比例明顯升高，無血清培養(yǎng)基有利于CD133+CD2

18、00-、CD133-CD200+和CD133+CD200+細胞的增殖生長。流式結果顯示，CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-細胞流式分選后，流式細胞檢測純度達到90％以上。
　　 2.倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長狀況將Colo205細胞在SFM中培養(yǎng)，第1天觀察發(fā)現(xiàn)大部分細胞貼壁生長，第2-6天，部分細胞懸浮并緊密連接生長，另一部分細胞凋亡，第7天后，開始形成不規(guī)

19、則的腫瘤干細胞球，球內(nèi)細胞折光性好，連接緊密，不能準備區(qū)分細胞與細胞間界限。隨著細胞的繼續(xù)傳代，腫瘤細胞能夠自我更新和保持增殖生長，仍然能在無血清培養(yǎng)基中生長并逐漸形成腫瘤干細胞球。而常規(guī)SSM培養(yǎng)的Colo205細胞不能形成腫瘤干細胞球。我們將SFM中的大腸癌細胞利用流式分選所得的CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-四組細胞重懸于SFM中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CD133+CD200

20、-和CD133+CD200+細胞能夠形成腫瘤干細胞球，而CD133-CD200+、CD133-CD200-細胞則不能形成腫瘤干細胞球，隨著細胞連續(xù)傳4代，CD133CD200+仍能在無血清培養(yǎng)基中生長，而CD133-CD200細胞逐漸出現(xiàn)凋亡。
　　 3.細胞免疫熒光將SSM組和SFM組的大腸癌細胞進行CD133、CD200、ALDH1細胞免疫熒光鑒定。發(fā)現(xiàn)SFM組中大腸癌干細胞球高表達CD133、CD200及ALDH1，并且C

21、D133和ALDH1，CD200和ALDH1兩者共表達。而SSM組CD133、CD200、ALDH1低表達或者陰性表達。
　　 4.NOD/SCID小鼠皮下成瘤實驗為了研究CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-四組細胞的致瘤能力，我們分別將細胞注射入NOD/SCID小鼠皮下。我們的研究發(fā)現(xiàn)103個CD133+CD200-、CD133+CD200細胞足以形成腫瘤，而同

22、樣細胞數(shù)的CD133-CD200+、CD133-CD200-細胞則不能形成腫瘤。104 CD133+CD200+組在第8天開始形成腫瘤，104 CD133+CD200-組在第14天開始形成腫瘤，104 CD133+CD200+、CD133+CD200-、CD133-CD200+組分別在第8、16、24、32天形成的腫瘤體積差異有統(tǒng)計學意義，P值分別為0.025，0.020，0.000，0.002，其中104 CD133+CD200+組更

23、快形成腫瘤，且在第32天腫瘤體積比同樣細胞數(shù)CD133+CD200-、CD133℃D200+組形成腫瘤體積大，而104個CD133-CD200-細胞則不能形成腫瘤。104 CD133+CD200+、CD133+CD200-和CD133-CD200+組32天后腫瘤組織的重量分別為(0A6±0.16)g，（0.27±0.05）g和（0.07±0.02）g。三組及兩兩之間腫瘤組織的重量差異有統(tǒng)計學意義，P值均小于0.05。CD133+CD20

24、0+組腫瘤重于CD133+CD200-、CD133-CD200+組;而CD133+CD200-組重于CD133-CD200+組。我們的研究結果顯示CD133+CD200+細胞表現(xiàn)出具有更強的致瘤能力。
　　 5.HE染色及ALDH1表達對105個CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-組的腫瘤標本進行HE染色和ALDH1免疫組織化學檢測，研究發(fā)現(xiàn)四組腫瘤組織均為低分化

25、，而ALDH1主要表達在腫瘤細胞的細胞質中，CD133+CD200-、CD133-CD200+和CD133+CD200+組的腫瘤組織ALDH1表達均為陽性，而CD133-CD200-組ALDH1表達弱陽性。
　　 結論：
　　 1.CD200與CD133+Colo205大腸癌細胞共表達流式檢測發(fā)現(xiàn)CD133+細胞與CD200+細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后細胞比例明顯升高，表明CD133+細胞與CD200+細胞能夠在無血

26、清培養(yǎng)基中自我更新和增殖生長。本實驗發(fā)現(xiàn)CD200與CD133+Colo205細胞共表達的細胞亞群，且CD200+細胞中大部分是CD133+CD200+細胞。
　　 2.大腸癌干細胞球高表達CD133、CD200及ALDH1無血清培養(yǎng)Colo205細胞形成的大腸癌干細胞球高表達CD133、CD200及ALDH1，且CD133與ALDH1，CD200與ALDH1共表達。CD133是未分化的標志，表明大腸癌干細胞球富含未分化細胞，C

27、D200在大腸癌干細胞球高表達，推測CD200與大腸癌干細胞有著密切的關系。
　　 3.CD133+CD200+細胞能夠形成腫瘤干細胞球及具有更強的致瘤能力篩選所得的CD133+CD200+細胞仍能在無血清培養(yǎng)基中形成腫瘤干細胞球，具有自我更新和增殖生長的特性。動物成瘤實驗顯示CD133+CD200+細胞具有更強的自我更新、增殖分化和致瘤能力。
　　 4.CD133+CD200+細胞可能是大腸癌干細胞其中一個細胞亞群，C

28、D200可能作為大腸癌干細胞候選的表面標志物之一流式結果顯示CD133+CD200+細胞占腫瘤細胞的極少數(shù)，符合腫瘤干細胞的定義之一，及其具有更強自我更新、增殖分化和致瘤能力，能夠在無血清培養(yǎng)基中形成腫瘤干細胞球。CD200與大腸癌干細胞表面標志物CD133共表達，且與腫瘤免疫中免疫逃逸的機制及腫瘤復發(fā)密切相關，由此推測CD133+CD200+細胞可能是大腸癌干細胞其中一個細胞亞群，CD200可能作為大腸癌干細胞候選的表面標志物之一。<