CD200與CD133+Colo205大腸癌細(xì)胞共表達(dá)及成瘤實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：
　　 大腸癌是嚴(yán)重危害人類健康也是最常見的惡性腫瘤之一，在西方發(fā)達(dá)國家其發(fā)病率居于惡性腫瘤的第2位，在我國隨著人類生活水平的提高及膳食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升趨勢。但是，由于大腸癌起病隱匿、進(jìn)展較快、早期診斷困難，患者就診時(shí)常處于中晚期，故失去手術(shù)機(jī)會(huì)的病例較多，部分患者接受放化療后仍早期復(fù)發(fā)，直接導(dǎo)致大腸癌預(yù)后差，病死率高，所以研究大腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找治療靶點(diǎn)，對(duì)大腸癌的治療非常重要。腫瘤的發(fā)生

2、、發(fā)展是一個(gè)多因素參與、多基因改變、多步驟發(fā)展的復(fù)雜過程。在腫瘤的研究過程中，人們提出的腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤組織中極少量的腫瘤細(xì)胞亞群，具有自我更新、增殖、分化、強(qiáng)致瘤性等潛能，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。腫瘤干細(xì)胞則是腫瘤不斷生長、腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的罪魁禍?zhǔn)?，因此，腫瘤干細(xì)胞已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。
　　 目前，惡性腫瘤常見的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物有CD133、CD44、ESA、ALDH1等，其中CD

3、133是目前被多數(shù)學(xué)者公認(rèn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，分選CD133+腫瘤干細(xì)胞亞群是富集大腸癌干細(xì)胞的一種有效方法，已應(yīng)用于多種類型腫瘤干細(xì)胞的篩選。Fang DD等發(fā)現(xiàn)CD133+大腸癌細(xì)胞亞群是具有干細(xì)胞特征，認(rèn)為CD133是大腸癌干細(xì)胞的標(biāo)志物。Dalerba P等研究證明CD44是大腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物。我們前期的研究將Colo205細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)和聯(lián)合檢測CD133及CD44的表達(dá)，為本實(shí)驗(yàn)對(duì)大腸癌干細(xì)胞的研究奠定基礎(chǔ)。
　　

4、 腫瘤免疫編輯學(xué)說認(rèn)為在腫瘤的整個(gè)發(fā)展過程中，機(jī)體免疫系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞之間存在著相互作用，免疫系統(tǒng)重塑腫瘤細(xì)胞的抗原性，腫瘤細(xì)胞影響著免疫系統(tǒng)的功能。從細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化開始到臨床上出現(xiàn)可檢測到的腫瘤為止，免疫系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用分為三個(gè)階段:清除階段，平衡階段，逃逸階段。在腫瘤發(fā)生之前，免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別腫瘤細(xì)胞和起到免疫殺傷作用。但是，腫瘤干細(xì)胞可以利用免疫逃逸機(jī)制，可能對(duì)腫瘤產(chǎn)生免疫抑制或免疫耐受。由此可見，大腸癌腫瘤干細(xì)胞的存

5、在與腫瘤免疫之間的密切關(guān)系，是使腫瘤不斷發(fā)展的重要原因。
　　 腫瘤干細(xì)胞理論指出結(jié)腸癌的發(fā)病、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)與大腸癌干細(xì)胞有關(guān)。然而，機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)大腸癌干細(xì)胞的免疫識(shí)別、大腸癌腫瘤干細(xì)胞在誘導(dǎo)腫瘤免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受的作用及其機(jī)制仍然不明確，針對(duì)大腸癌干細(xì)胞免疫治療也在起始階段。因此，進(jìn)一步探討和研究大腸癌干細(xì)胞與腫瘤免疫之間的關(guān)系至關(guān)重要。
　　 研究表明CD200具有免疫調(diào)節(jié)作用，CD200是一種Ⅰ型膜糖蛋白，是高度保

6、守的免疫超家族成員，可以表達(dá)在骨髓系統(tǒng)的細(xì)胞中包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，同樣表達(dá)在B細(xì)胞、活化T細(xì)胞等。MoreauxJ等證實(shí)CD200 mRNA高表達(dá)于結(jié)腸癌、腎癌、頭頸部癌等腫瘤中，并且高表達(dá)者具有更差的預(yù)后。Kawasaki BT等通過流式檢測發(fā)現(xiàn)CD200與前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、結(jié)腸癌的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物例如CD44，CD133等共表達(dá)，提出CD200可能是前列腺癌、乳腺癌、腦瘤、結(jié)腸癌的

7、腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物之一。最近研究已證實(shí)CD200在器官移植、自身免疫疾病、腫瘤免疫中有重要的作用并與疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。為此讓CD200在大腸癌干細(xì)胞研究奠定了基礎(chǔ)，也提示CD200介導(dǎo)的大腸癌干細(xì)胞與腫瘤免疫密切相關(guān)。目前，CD200在大腸癌的研究仍處于初步階段，本實(shí)驗(yàn)對(duì)CD200與大腸癌細(xì)胞CD133及ALDH1共表達(dá)及其之間的相互關(guān)系進(jìn)行初步研究。為CD200介導(dǎo)的大腸癌腫瘤免疫研究，以及大腸癌預(yù)后的指導(dǎo)、靶向治療等方面提供

8、了新的科研視角。因此，研究CD200與大腸癌于細(xì)胞之間的關(guān)系，尋找治療的靶點(diǎn)，對(duì)大腸癌的治療至關(guān)重要。
　　 材料與方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)含血清培養(yǎng)基(serum-supplimented medium，SSM)為10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基（serum-free medium，SFM）由DMEM/F12(1∶1)、B27(1∶50)、EGF(20ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、L

9、IF(10ng/ml)組成。將Colo205細(xì)胞接種于SSM中培養(yǎng)，細(xì)胞處于生長期時(shí)用PBS液清洗，胰酶消化，重懸Colo205細(xì)胞接種到SFM中進(jìn)行培養(yǎng)。
　　 2.流式細(xì)胞檢測離心收集SSM組和SFM組（培養(yǎng)2周）的Colo205細(xì)胞，分別取80ul細(xì)胞懸液（約含106個(gè)細(xì)胞），加入FCR阻斷劑、Anti-CD200-APC、Anti-CD133-PE標(biāo)記，4℃孵育20分鐘，并設(shè)有同型對(duì)照組，上機(jī)檢測CD133+CD200-

10、、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-細(xì)胞的比例。
　　 3.細(xì)胞免疫熒光將SFM組的腫瘤細(xì)胞離心收集，以SSM組作為對(duì)照，加PBS重懸細(xì)胞后涂片，4％多聚甲醛固定，0.2％ Triton X-100破膜，10％正常山羊血清封閉，加入鼠抗人CD133抗體、兔抗人ALDH1抗體（或鼠抗人CD200抗體、兔抗人ALDH1抗體）混勻4℃孵育過夜，PBS洗滌后加入anti-mouse-594、an

11、ti-rabbit-488熒光標(biāo)記二抗，并設(shè)有陰性對(duì)照，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染細(xì)胞核，抗熒光淬滅劑封片，鏡檢。
　　 4.流式細(xì)胞分選將SFM組大腸癌細(xì)胞離心收集（約1×108個(gè)細(xì)胞），加入FCR阻斷劑、Anti-CD200-APC、Anti-CD133-PE標(biāo)記，4℃孵育20分鐘，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞分選，并分選出CD133+CD200-、CD133

12、-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-四組細(xì)胞，培養(yǎng)后再進(jìn)行第二次流式細(xì)胞檢測。
　　 5.倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況倒置顯微鏡觀察含血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基中Colo205細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況;用同樣的方法觀察無血清培養(yǎng)基中CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況。
　　 6.NOD/SCID小鼠皮下成

13、瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，并在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)。將分選后的CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-細(xì)胞，分別用PBS重懸，取100ul單個(gè)細(xì)胞懸液與100ul Matrigel膠1∶1(V/V)混合，并分別按103、104、105個(gè)CD133+CD200-、CD133-CD200+及CD133+CD200+

14、細(xì)胞無菌皮下注射注入NOD/SCID小鼠左上背部，并以同樣細(xì)胞數(shù)的CD133-CD200-細(xì)胞注射右下背部作為對(duì)照。每2天觀察一次，用游標(biāo)卡尺測量瘤體大小，記錄瘤體的變化，瘤體體積用以下公式計(jì):V=(π×L×W2)/6(V，體積;L，長;W，寬)，繪制成瘤生長曲線，32天后將NOD/SCID小鼠安樂死，剔除出腫瘤組織。
　　 7.HE染色和免疫組織化學(xué)染色HE染色:將小鼠的皮下腫瘤組織用4％多聚甲醛固定，乙醇和二甲苯脫水和透明，

15、石蠟包埋、石蠟切片HE染色。免疫組化染色:石蠟切片，用二甲苯、乙醇脫蠟和水化，3％過氧化氫孵育，加入EDTA抗原修復(fù)液并于微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗滌后加10％正常山羊血清封閉，兔抗人ALDH1抗體(1∶200)4℃孵育過夜，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，加入二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，分化和返藍(lán)，乙醇脫水和二甲苯透明，中性樹膠封片。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組

16、均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和兩個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用One-Way ANOVA和多個(gè)獨(dú)立樣本參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.流式檢測CD133+細(xì)胞與CD200+細(xì)胞的比例在SSM組Colo205細(xì)胞CD133+CD200-、CD133-CD200+及CD133+CD200+細(xì)胞的比例分別為(1.68±0.94)％、(0.94±0.67)％、(0.68±0.22)％，

17、而在SFM組的比例分別為(19.72±2.36)％、（9.56±1.00）％、（3.02±0.93）％，兩組間各細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均小于0.05。SFM組CD133+CD200-、CD133-CD200+和CD133+CD200+細(xì)胞的比例均高于SSM組。將Colo205細(xì)胞在SFM中進(jìn)行培養(yǎng)，CD133+CD200-、CD133-CD200+和CD133+CD200+細(xì)胞的比例明顯升高，無血清培養(yǎng)基有利于CD133+CD2

18、00-、CD133-CD200+和CD133+CD200+細(xì)胞的增殖生長。流式結(jié)果顯示，CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-細(xì)胞流式分選后，流式細(xì)胞檢測純度達(dá)到90％以上。
　　 2.倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀況將Colo205細(xì)胞在SFM中培養(yǎng)，第1天觀察發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞貼壁生長，第2-6天，部分細(xì)胞懸浮并緊密連接生長，另一部分細(xì)胞凋亡，第7天后，開始形成不規(guī)

19、則的腫瘤干細(xì)胞球，球內(nèi)細(xì)胞折光性好，連接緊密，不能準(zhǔn)備區(qū)分細(xì)胞與細(xì)胞間界限。隨著細(xì)胞的繼續(xù)傳代，腫瘤細(xì)胞能夠自我更新和保持增殖生長，仍然能在無血清培養(yǎng)基中生長并逐漸形成腫瘤干細(xì)胞球。而常規(guī)SSM培養(yǎng)的Colo205細(xì)胞不能形成腫瘤干細(xì)胞球。我們將SFM中的大腸癌細(xì)胞利用流式分選所得的CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-四組細(xì)胞重懸于SFM中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CD133+CD200

20、-和CD133+CD200+細(xì)胞能夠形成腫瘤干細(xì)胞球，而CD133-CD200+、CD133-CD200-細(xì)胞則不能形成腫瘤干細(xì)胞球，隨著細(xì)胞連續(xù)傳4代，CD133CD200+仍能在無血清培養(yǎng)基中生長，而CD133-CD200細(xì)胞逐漸出現(xiàn)凋亡。
　　 3.細(xì)胞免疫熒光將SSM組和SFM組的大腸癌細(xì)胞進(jìn)行CD133、CD200、ALDH1細(xì)胞免疫熒光鑒定。發(fā)現(xiàn)SFM組中大腸癌干細(xì)胞球高表達(dá)CD133、CD200及ALDH1，并且C

21、D133和ALDH1，CD200和ALDH1兩者共表達(dá)。而SSM組CD133、CD200、ALDH1低表達(dá)或者陰性表達(dá)。
　　 4.NOD/SCID小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)為了研究CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-四組細(xì)胞的致瘤能力，我們分別將細(xì)胞注射入NOD/SCID小鼠皮下。我們的研究發(fā)現(xiàn)103個(gè)CD133+CD200-、CD133+CD200細(xì)胞足以形成腫瘤，而同

22、樣細(xì)胞數(shù)的CD133-CD200+、CD133-CD200-細(xì)胞則不能形成腫瘤。104 CD133+CD200+組在第8天開始形成腫瘤，104 CD133+CD200-組在第14天開始形成腫瘤，104 CD133+CD200+、CD133+CD200-、CD133-CD200+組分別在第8、16、24、32天形成的腫瘤體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.025，0.020，0.000，0.002，其中104 CD133+CD200+組更

23、快形成腫瘤，且在第32天腫瘤體積比同樣細(xì)胞數(shù)CD133+CD200-、CD133℃D200+組形成腫瘤體積大，而104個(gè)CD133-CD200-細(xì)胞則不能形成腫瘤。104 CD133+CD200+、CD133+CD200-和CD133-CD200+組32天后腫瘤組織的重量分別為(0A6±0.16)g，（0.27±0.05）g和（0.07±0.02）g。三組及兩兩之間腫瘤組織的重量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均小于0.05。CD133+CD20

24、0+組腫瘤重于CD133+CD200-、CD133-CD200+組;而CD133+CD200-組重于CD133-CD200+組。我們的研究結(jié)果顯示CD133+CD200+細(xì)胞表現(xiàn)出具有更強(qiáng)的致瘤能力。
　　 5.HE染色及ALDH1表達(dá)對(duì)105個(gè)CD133+CD200-、CD133-CD200+、CD133+CD200+及CD133-CD200-組的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行HE染色和ALDH1免疫組織化學(xué)檢測，研究發(fā)現(xiàn)四組腫瘤組織均為低分化

25、，而ALDH1主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，CD133+CD200-、CD133-CD200+和CD133+CD200+組的腫瘤組織ALDH1表達(dá)均為陽性，而CD133-CD200-組ALDH1表達(dá)弱陽性。
　　 結(jié)論：
　　 1.CD200與CD133+Colo205大腸癌細(xì)胞共表達(dá)流式檢測發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞與CD200+細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后細(xì)胞比例明顯升高，表明CD133+細(xì)胞與CD200+細(xì)胞能夠在無血

26、清培養(yǎng)基中自我更新和增殖生長。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD200與CD133+Colo205細(xì)胞共表達(dá)的細(xì)胞亞群，且CD200+細(xì)胞中大部分是CD133+CD200+細(xì)胞。
　　 2.大腸癌干細(xì)胞球高表達(dá)CD133、CD200及ALDH1無血清培養(yǎng)Colo205細(xì)胞形成的大腸癌干細(xì)胞球高表達(dá)CD133、CD200及ALDH1，且CD133與ALDH1，CD200與ALDH1共表達(dá)。CD133是未分化的標(biāo)志，表明大腸癌干細(xì)胞球富含未分化細(xì)胞，C

27、D200在大腸癌干細(xì)胞球高表達(dá)，推測CD200與大腸癌干細(xì)胞有著密切的關(guān)系。
　　 3.CD133+CD200+細(xì)胞能夠形成腫瘤干細(xì)胞球及具有更強(qiáng)的致瘤能力篩選所得的CD133+CD200+細(xì)胞仍能在無血清培養(yǎng)基中形成腫瘤干細(xì)胞球，具有自我更新和增殖生長的特性。動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)顯示CD133+CD200+細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新、增殖分化和致瘤能力。
　　 4.CD133+CD200+細(xì)胞可能是大腸癌干細(xì)胞其中一個(gè)細(xì)胞亞群，C

28、D200可能作為大腸癌干細(xì)胞候選的表面標(biāo)志物之一流式結(jié)果顯示CD133+CD200+細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的極少數(shù)，符合腫瘤干細(xì)胞的定義之一，及其具有更強(qiáng)自我更新、增殖分化和致瘤能力，能夠在無血清培養(yǎng)基中形成腫瘤干細(xì)胞球。CD200與大腸癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133共表達(dá)，且與腫瘤免疫中免疫逃逸的機(jī)制及腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)，由此推測CD133+CD200+細(xì)胞可能是大腸癌干細(xì)胞其中一個(gè)細(xì)胞亞群，CD200可能作為大腸癌干細(xì)胞候選的表面標(biāo)志物之一。<