GRIM-19與HPV18E6的相互作用促子宮頸癌細(xì)胞p53蛋白積聚的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。全世界每年大約有47萬(wàn)新發(fā)宮頸癌病例,23萬(wàn)女性死于宮頸癌,其中大部分(約80％)發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家,嚴(yán)重威脅女性健康。子宮頸癌的病因至今尚未完全明了,目前認(rèn)為與早婚,性生活過(guò)早及混亂,早年分娩多產(chǎn),吸煙,經(jīng)濟(jì)情況差及地理環(huán)境等因素有關(guān),高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)持續(xù)感染在子宮頸癌的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用,幾乎所有的宮頸癌患者中都可檢測(cè)到高危型HPVDNA,70%以上的

2、宮頸癌病變中存在HPV基因組的整合。
　　Haraldzur Hausen首先提出感染HPV與宮頸癌的發(fā)病機(jī)制相關(guān),并因此獲得諾貝爾獎(jiǎng),現(xiàn)已證實(shí),高危型HPV,如HPV16、HPV18型編碼的早期癌蛋白E6和E7可分別與P53和Rb結(jié)合,使這兩種抑癌基因降解,最終導(dǎo)致子宮頸癌的發(fā)生。E6蛋白是一個(gè)小分子堿性蛋白,約160個(gè)氨基酸,主要位于細(xì)胞核內(nèi)。HPVE6在病毒的生活周期中以及在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起重要作用,E6蛋白的致癌作用主要表現(xiàn)在

3、結(jié)合p53,促使p53進(jìn)入泛素依賴(lài)的降解途徑而被降解,E6AP(E6-associated protein)在此過(guò)程發(fā)揮了重要作用。E6AP是泛素-蛋白連接酶(ubiquitin-activatingenzyme,E3)中HECT結(jié)構(gòu)域家族中的一員。E6首先招募E6AP泛素酶而形成復(fù)合體,然后與P53結(jié)合,E6AP將活化的泛素轉(zhuǎn)移至p53蛋白,p53則進(jìn)入泛素化降解途徑,最終在蛋白酶體26S的作用下被降解。與其他腫瘤如卵巢癌、肺癌等不同

4、,p53在子宮頸癌組中表現(xiàn)為野生型,半衰期短,蛋白表達(dá)水平低。E6對(duì)p53的作用是HPV增殖感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié),它的這一功能使基因異常的細(xì)胞得以持續(xù)增殖,最終導(dǎo)致感染細(xì)胞的惡化,成為腫瘤細(xì)胞。
　　GRIMs(genesassociated with retinoid-IFN-induced mortality)是一群參與干擾素(interferon,IFN)和維甲酸(retinoic acid,RA)合并誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡基因,是Kal

5、vakolanu用反義RNA敲除技術(shù)在乳腺癌細(xì)胞中篩選鑒定并首先報(bào)道的凋亡蛋白。GRIM-19屬GRIMs家族成員,定位于19p13.2,是參與細(xì)胞線粒體的呼吸作用和調(diào)控細(xì)胞凋亡的新基因,該區(qū)的多種基因?yàn)榍傲邢侔┑囊种苹?。GRIM-19編碼含144個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì),分子量約16kd,主要定位在線粒體,細(xì)胞核也有少量表達(dá),在人體多種正常組織中均有其表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)GRIM-19的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡,其表達(dá)降低或位點(diǎn)突變可以導(dǎo)致細(xì)胞的

6、異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。許多腫瘤中,如甲狀腺腫瘤、口腔癌、腎癌、結(jié)直腸癌等中均發(fā)現(xiàn)GRIM-19表達(dá)的降低。GRIM-19是STAT3表達(dá)和激活的負(fù)性調(diào)節(jié)子,而STAT3在許多腫瘤中處于持續(xù)激活狀態(tài),是腫瘤治療的新靶點(diǎn)。GRIM-19與其結(jié)合后,抑制其激活引起的下游基因的轉(zhuǎn)錄,這一結(jié)合作用是在GRIM-19的絲氨酸727轉(zhuǎn)激活位點(diǎn)完成的。但是GRIM-19在子宮頸癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的具體作用尚不清楚。
　　本課題組前期試驗(yàn)已證實(shí)

7、在子宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa和CaSki細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)GRIM-19可以上調(diào)p53及其下游基因p21、PUMA的表達(dá),而HPV陰性的卵巢癌細(xì)胞株H08910細(xì)胞中卻并未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象,因此推論GRIM-19具有誘導(dǎo)子宮頸癌細(xì)胞株中p53蛋白積聚的重要作用,這種作用的發(fā)揮是依靠抑制p53蛋白的降解,延長(zhǎng)其半衰期,而在子宮頸癌細(xì)胞中p53的降解主要是依靠E6來(lái)實(shí)現(xiàn)。本試驗(yàn)將以18E6為研究對(duì)象,進(jìn)一步的研究子宮頸癌細(xì)胞中GRIM-19與HP

8、V18E6的相互作用及對(duì)子宮頸癌細(xì)胞p53蛋白積聚的作用機(jī)制。
　　目的：
　　研究子宮頸癌細(xì)胞中GRIM-19與HPV18E6的相互作用及對(duì)子宮頸癌細(xì)胞p53蛋白積聚的作用機(jī)制研究,為子宮頸癌的治療提供理論依據(jù)及治療線索。
　　方法：
　　⑴構(gòu)建GRIM-19,HPV18E6原核表達(dá)質(zhì)粒:pGEX-4T-3-GRIM-19(pGST-G19)、pET-22b-18E6-Flag(pET-E6),18E6真核表達(dá)

9、質(zhì)粒p3×Flag-CMV-Myc-24-18E6(p3×Flag-E6);⑵RT-PCR方法檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pGRIM-19后子宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞中E6的表達(dá);⑶體內(nèi)泛素試驗(yàn)檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GRIM-19后子宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞中p53泛素化的影響;⑷采用免疫共沉淀方法(CO-IP)檢測(cè)GRIM-19與E6的蛋白體內(nèi)結(jié)合作用;⑸采用GSTpulldown方法檢測(cè)GRIM-19與18E6的蛋白體外結(jié)合作用;⑹采用GSTpulldown

10、競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)E6AP與18E6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GRIM-19的作用。
　　結(jié)果：
　　⑴RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pGRIM-19后子宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞中HPV18E6表達(dá)較對(duì)照組無(wú)變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p>0.05;⑵體內(nèi)泛素試驗(yàn)結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pGRIM-19后子宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞中p53泛素化減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p<0.05;⑶CO-IP方法檢測(cè)結(jié)果顯示在宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞中GRIM-19與1

11、8E6在體內(nèi)具有蛋白結(jié)合作用,與p53沒(méi)有蛋白結(jié)合作用;⑷GSTpulldown方法檢測(cè)結(jié)果顯示GRIM-19與18E6在體外具有蛋白結(jié)合作用;⑸GSTpulldown競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示E6AP具有競(jìng)爭(zhēng)18E6結(jié)合GRIM-19的作用。
　　結(jié)論：
　　GRIM-19與18E6具有蛋白結(jié)合作用,而與p53沒(méi)有蛋白結(jié)合作用;GRIM-19誘導(dǎo)HR-HPV感染的子宮頸癌細(xì)胞中p53蛋白積聚的作用機(jī)制是通過(guò)與E6蛋白結(jié)合,阻礙E