HPV16E6與Daxx相互作用的效果及機(jī)制.pdf

1、目的：研究人乳頭瘤病毒16型(HPV16) E6蛋白與Daxx相互作用對(duì)其DNA啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，分析 Daxx對(duì)E6 DNA復(fù)制的影響，為進(jìn)一步探討 Daxx在HPV16 E6致癌機(jī)制中的作用提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。
　　方法：
　　(1)培養(yǎng)Caski細(xì)胞，經(jīng)甲醛交聯(lián)固定，超聲破碎細(xì)胞，離心收集上清液，將上清液分4組：A組（實(shí)驗(yàn)組）加入兔抗HPV16 E6 IgG，B組（陽(yáng)性對(duì)照組）加入Anti-RNA polymer

2、aseⅡ抗體，C組為 Input，D組（陰性對(duì)照組）加入小鼠 IgG?？贵w孵育過(guò)夜后加入Protein G Agarose沉淀抗原抗體復(fù)合物，并用洗脫液清洗，收集上清液，65℃過(guò)夜解交聯(lián)后回收DNA樣品， PCR分析Daxx基因片段。
　　(2)用Prime5.0軟件分別設(shè)計(jì)Daxx基因啟動(dòng)子序列片段 Daxx-1~-695nt、Daxx-1~-161nt與Daxx-161~-695nt引物，引入NcoI/HindⅢ酶切位點(diǎn)，以D

3、axx基因組為模板PCR擴(kuò)增目的基因，分別用NcoI/HindⅢ雙酶切PCR產(chǎn)物和PGL3-basic質(zhì)粒，純化回收酶切產(chǎn)物，用T4連接酶鏈接后，轉(zhuǎn)化至E.coli，經(jīng)雙酶切鑒定及DNA序列分析，篩選陽(yáng)性克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-basic/Daxx-1~-695nt、Daxx-1~-161nt與Daxx-161~-695nt。
　　(3)將質(zhì)粒pGL3-basic、pGL3-basic/Daxx-1~-695n t、pGL3-

4、basic/Daxx-1~-161nt、pGL3-basic/Daxx-161~-695nt分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染，或與質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/HPV16 E6共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，24h和48h后，裂解細(xì)胞，收集上清液，加入熒光素酶試劑，熒光測(cè)定儀檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度。
　　(4)分別將質(zhì)粒pEGFP-c1和pEGFP-c1/Daxx瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，24h和48h后分別裂解細(xì)胞提取總RNA，以質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/HPV16 E

5、6作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行絕對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)，分析HPV16 E6基因的拷貝數(shù)。
　　結(jié)果：
　　(1)在HPV16 E6抗體沉淀的染色質(zhì)免疫復(fù)合物中，PCR擴(kuò)增到Daxx基因片段。
　　(2) Daxx啟動(dòng)子截?cái)嗥尉_地連入載體pGL3-basic，即成功構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic/Daxx-1~-695nt、Daxx-1~-161nt和Daxx-161~-695nt。
　　(3)質(zhì)粒pG

6、L3-basic/Daxx-1~-695nt、Daxx-1~-161nt和Daxx-161~-695nt能在Hela細(xì)胞激活Daxx-1~-695nt和Daxx-1~-161nt和Daxx-161~-695nt啟動(dòng)子活性，在共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/E6的Hela細(xì)胞，下調(diào)Daxx-1~-695nt、和Daxx-1~-161nt和Daxx-161~-695nt啟動(dòng)子活性，且啟動(dòng)子Daxx-161~-695nt活性最低。
　

7、　(4)在pEGFP-c1與pEGFP-c1/Daxx轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞均有綠色熒光蛋白表達(dá)。GFP高表達(dá)時(shí)，HPV16 E6基因的復(fù)制水平未出現(xiàn)顯著變化；融合蛋白GFP-Daxx高表達(dá)時(shí)， HPV16 E6基因的復(fù)制水平下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　(1) HPV16 E6能結(jié)合Daxx DNA啟動(dòng)子-1~-161nt。
　　(2)構(gòu)建的質(zhì)粒 pGL3-basic/Daxx-1~-695nt、 pGL3-basic/Dax